Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
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Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. En 1985, Sir Alec Jeffreys descubrió los “polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción que en biología molecular, el término RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. En un cromosoma humano, una enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Los RFLP son marcadores génicos del ADN y se pueden encontrar en regiones que codifican proteínas o exones, en los intrones o en el ADN que separa un gen de otro. Lo único que se necesita para que puedan ser marcadores genéticos es que sean polimórficos teniendo más de un alelo. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.
Sumario
Metodología
El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido a un campo eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de las muestras según la técnica utilizada. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restricción varían. Las bandas pueden ser transferidas por Southern Blot a una membrana donde se hibridan con una sonda que permite determinar la longitud y la separación de los fragmentos. En este paso las cadenas de ADN tienen que estar desnaturalizadas, es decir, en forma de cadena sencilla para permitir la hibridación con las sondas específicas. Las endonucleasas de restricción en su mayoría cortan el ADN de cadena doble en secuencias específicas y cada enzima reconoce un sitio en particular. Un ejemplo es la EcoRI: corta solamente cuando encuentra la secuencia 5`…G/AATTC…3` en la doble hélice. Para esta técnica, es importante seleccionar endonucleasas que corten en sitios específicos y no sea en secuencias degeneradas.
Aplicaciones
El análisis de la variación de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta fundamental en el mapeo genómico y el análisis de enfermedades genéticas. Cuando los investigadores pretendían determinar la localización cromosómica de una determinada enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el análisis RFLP de otras familias podría predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quiénes tenían posibilidades de portar el gen mutante. También se ha usado este análisis para determinar el origen parental de muchas trisomías en humanos, e incluso para determinar en qué fase meiótica ocurrió el fenómeno desencadenante de la trisomía. El análisis RFLP fue también la base de las modernas técnicas de análisis de huellas genéticas (Genetic Fingerprinting analysis en inglés), útiles en la identificación de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones animales.
Diagnóstico de una enfermedad mediante screening de un marcador RFLP
Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen genético, la presencia o ausencia de éste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la enfermedad. La suposición es que el gen en el que los investigadores están realmente interesados está localizado tan cerca del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteración en el gen. A veces, un RFLP en particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es esencial examinar no sólo al paciente, sino a todos los miembros de la familia que sea posible. Las pruebas más útiles para tales análisis son las asociadas a una única secuencia del DNA; esto es, una secuencia que está presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA presenta una función que es desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente sin dañar al individuo. La muestra del sujeto sometido al diagnóstico hibridará con distintas longitudes de DNA digerido de diferentes personas dependiendo de los sitios de corte de la enzima que haya heredado. Una gran variedad de polimorfismos puede presentarse en la población, obteniendo una gran colección de alelos. Algunas personas serán homocigotos y presentarán una única banda, otros (ej., todos los miembros de la familia mostrados abajo) serán heterocigotos y presentarán una banda distinta por cada alelo.
El pedigrí
El pedigrí muestra la herencia del marcador RFLP a través de tres generaciones en una sola familia. Un total de 8 alelos (numerados a la izquierda del gel) están presentes en la familia. Los RFLPs de cada miembro de la familia están enumerados justo debajo de ellos. Si, por ejemplo, cada persona que heredó el alelo RFLP 2 tuviera también cierto desorden heredado, y ninguno de los que carecieran del alelo tuviera la afección, deduciríamos que el gen de la enfermedad está ligado de manera muy próxima al RFLP. Si los padres decidieran tener otro hijo, un test prenatal podría revelar si el niño presentaría la enfermedad. Pero destacar que el cruzamiento durante la formación de los gametos podría mover el marcador RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia entre el RFLP y el locus del gen, disminuye la probabilidad de un diagnóstico preciso.
