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Cultivos puros

Cultivos Puros
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Concepto:son aquellos que contienen un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula.

Cultivos puros: son aquellos que contienen un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones).

Historia

El problema de separar una especie microbiana de las otras, de tal manera que pueda crecer en cultivo puro, fue solucionado en el laboratorio del famoso microbiólogo alemán Roberto Koch (1843-1910). Koch, tal como lo hicieron otros biólogos, descubrió que debería emplearse un medio sólido en lugar del líquido si se deseaban obtener cultivos microbianos puros. Como ocurre frecuentemente en la ciencia, los descubrimientos de Koch y su grupo estaban basados en las observaciones de algún otro investigador.

En 1872, Johann Samuel Schroeter notó que las bacterias crecían sobre la superficie de materiales diversos, incluyendo la superficie de una papa cortada. Aquí las bacterias daban lugar a la formación de una masa relativamente grande a la que después se le denominó colonia.Cuando estas colonias individuales fueron examinadas al microscopio, se encontró que cada una de ellas estaba formada por cantidades enormes de bacterias; pero el asunto más importante era que todos los organismos de una misma colonia pertenecían a la misma especie.

Aparentemente, las células individuales habían caído del aire, tocando la superficie de la papa en un cierto lugar, multiplicándose ahí hasta producir millones de individuos, con lo que las colonias se hacían visibles a simple vista. Todas las bacterias de una sola colonia habrían derivado de una sola célula, y, por lo tanto, cada colonia constituía un cultivo puro.

Características de los cultivos puros

  • Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color.
  • Que no existan formas inhibidas.
  • Al microscopio deben tener un aspecto común.
  • Tiene que tener iguales propiedades tintoriales
  • Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales..
  • Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

Técnica de la siembra

La técnica para el aislamiento comienza preparando un inóculo de siembra, que es la deposición de una pequeña porción de la muestra en el medio o en los medios de cultivo adecuado, en función de las especies microbianas que se espera encontrar. Por eso existen distintos métodos o tipos de siembra, en función de la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculación y la siembra para aislamiento.

  • Siembra para inoculación: la inoculación consiste en tomar una pequeña porción de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con más facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio líquido o en medio sólido.
  • Siembra para aislamiento: la finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo sólidos.

Existen varios tipos de siembras para aislamiento:Siembra en estría o zig-zag, siembra por estría múltiple, siembra de los cuatro cuadrantes, siembra de los tres giros.

Métodos para obtener los cultivos puros

  • Método de siembra para aislamiento por agotamiento o en estría

Materiales

  • Placa petri con medio de cultivo
  • Muestra (sólida o líquida)
  • Asa de siembra de platino

Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

  • Estría única: depositamos la muestra lo más alejado de nosotros y realizamos la siembra en forma de zig-zag. De esta forma vamos descargando la muestra del asa. Es importante no volver a repasar el trozo de medio de cultivo que ya hemos sembrado. Para conseguir que al final de la estría tengamos colonias aisladas es importante que al principio hagamos la estría más junta y que la cantidad de muestra tomada en el asa sea la adecuada.
  • Estría múltiple: en esta técnica de aislamiento por agotamiento se realizan varias estrías. Esto se puede llevar a cabo flameando el asa de paso en paso, es decir, de estría en estría, o sin flamear el asa. Además, dependiendo de la forma en la que hagamos las estrías, existen varios tipos de estriados:

Estriado sobre cuatro cuadrantes: Se utiliza cuando queremos conservar algún microorganismo que nos interesa. Consiste en sembrar uno a uno los cuadrantes, sin flamear el asa entre estría y estría, de tal forma que en el cuarto cuadrante, al ir agotando la muestra del asa, tendremos los microorganismos aislados.

  • Esterilizando asa entre siembra y siembra: consiste en realizar un primer estriado en uno de los extremos de la placa, esterilizar el asa, girar un poco la placa y realizar otro estriado introduciendo el asa en el primer estriado para ir arrastrando la muestra y volver a repetir esta operación con un tercer estriado:
  • Sin esterilizar el asa entre siembra y siembra: Se lleva a cabo igual que en el caso anterior salvo en que en esta técnica no se flamea el asa entre la realización de los estriados y por lo tanto no es necesario arrastrar la muestra de las primeras siembras.

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  • Método de siembra para aislamiento por diluciones sucesivas

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas.

  • Metodología: ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 ºC durante 24 horas.

En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas. Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra que estamos analizando: N=C · 1/D · 1/i

donde:

N es el número de microorganismos presentes en la muestra

C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)

D es la dilución

I es el inóculo

Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas.

  • Técnica del cultivo por enriquecimiento

Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas. Ejemplo: queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofos. Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º.

Conservación de cultivos puros

  • Almacenamiento a temperaturas bajas. Ponemos las bacterias con glicerol al 20 - 50% a -70º y podemos mantenerlas así durante años y décadas.
  • Liofilización: es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilización. La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de sólido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante décadas.
  • Colecciones de cultivo: en todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de cultivos tipo), que está en Valencia. La más grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).

Mantenimiento

  1. Debemos transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua.
  2. Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.
  3. Se disminuye la temperatura, congelamos las células. Para proteger las células y que no se formen cristales que las dañen se usa el glicerol
  4. La liofilización es la sublimación a alto vacío de las muestras congeladas con rapidez.

Fuente

  • Sasson, Albert. Las biotecnologías: desafíos y promesas Investigaciones Biológicas. La Habana.1984