Medios de cultivo para la propagación in vitro

Medios de cultivo para la propagación in vitro
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Medios de cultivo para la propagación in vitro. Constituyen un elemento fundamental para el cultivo in vitro de células, tejidos y órganos para lograr el desarrollo de los mismos in vitro. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Los medios de cultivo están constituidos por sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, reguladores del crecimiento y otros elementos.
El cultivo de células, tejidos y órganos de la plantas in vitro se realiza en medios de cultivos artificiales, lo cuales proporcionan los nutrientes necesario que la planta toma de la tierra en su habitad natural y precisamente el éxito de este tipo de cultivo esta influenciado grandemente por la naturaleza del medio de cultivo utilizado y otros factores ambientales.

Componentes inorgánicos del medio de cultivo

Los medios de cultivo están constituidos por componentes inorgánicos, los cuales son suministrados en cantidades relativamente grandes (macronutrientes) y otros añadidos en menor cantidad (micronutrientes).
Dentro de los macronutrientes, se encuentran iones de nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S).
El nitrógeno se adiciona al medio de cultivo en forma de nitrato o iones amonio, o la combinación de ambos iones, el sulfato de magnesio (Mg SO4 7H2O) satisface tanto el requerimiento de magnesio como el de azufre, el fósforo puede adicionarse en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O ó KH2PO4, el potasio es un catión que se agrega en forma de KCl, KNO3, ó KH2PO4, el calcio se adiciona con Ca Cl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O o la forma anhidra de cualquier sal y el cloro se presenta en forma de KCl ó CaCl2.
Los micronutrientes, que son añadidos a los medios de cultivo son hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), cinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y Molibdeno (Mo). Estos elementos junto con el carbono (el C), oxígeno (O) e hidrógeno (H) constituyen los 17 elementos esenciales. Estos micronutrientes aunque son requeridos en menor cantidad son necesarios para una adecuada actividad metabólica de las células vegetales. El Fe y el Mn son esenciales para la síntesis de clorofila y la función de los cloroplastos. El Fe es requerido para la formación de precursores de la clorofila y es un componente de los citocromos, ferredoxina y legohemoglobina, esta última es esencial en la fijación de nitrógeno por las plantas leguminosas. El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso fotosintético. Los elementos Cu y Zn son requeridos para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenólicos. El Zn está relacionado con la síntesis de triptófano, precursor del ácido indolacético (AIA) y ejerce control sobre las ribonucleasas lo que permite mantener la síntesis proteica en caso de estrés ambiental (medio de cultivo). El Cu, además es un componente de la Plastocianina que es esencial en el funcionamiento del transporte electrónico de la fotosíntesis y es activador de otras enzimas como la oxidasa del ácido ascórbico (Vitamina C), tirosinasa, lacasa, fenolasa y citocromoxidasa, esta última forma parte de la cadena de transporte electrónico del proceso respiratorio. El Mo forma parte de las nitratorreductasas de las plantas y nitrogenasas en leguminosas y bacterias fijadoras de nitrógeno. El boro (B) es necesario para el mantenimiento de la actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas, en particular uracilo y adenina y por ello aumenta los niveles de citocininas y ácidos nucleicos. Lugo el Fe es añadido en forma de quelato cuyas moléculas son capaces de retener un ión de un metal con varias uniones químicas form ando un anillo complejo (un quelato) como el EDTA (ácido etilendinitrotetraacético), que utilizado en bajas concentraciones estimula el crecimiento al hacer disponible en bajas cantidades este elemento.
El medio de cultivo más utilizado es la formulación de las sales Murashige y Skoog (1962) el cual fue desarrollado inicialmente para el crecimiento de callos de tabaco y en la actualidad se emplea como medio de cultivo basal para un grupo importantes de plantas de interés para la alimentación y con fines ornamentales. Sales minerales del medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962)

Ingredientes Cantidad en mg L-1)
NH4NO3 66 000
K NO3 76 000
Mg SO4.7H2O 14 800
KH2 PO4 6 800
Fe SO4.7H2O 1390
Na2 EDTA.2H2O 1865
CaCl2.2H2O 15172
H3BO3 6200
Mn SO4.H2O 16900
Zn SO4.7H2O 8600
Na2 MoO4.2 H2O 240
Cu SO4.5H2O 25
Co Cl2.6H2O 25
KI 83

Componentes orgánicos del medio de cultivo

Dentro de los componentes orgánicos del medio de cultivo se encuentran carbohidratos, vitaminas, aminoácidos, extractos naturales y reguladores del crecimiento vegetal.

Carbohidratos

La nutrición que es desarrollada en las condiciones in vitro a partir en los diferentes órganos y tejidos son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica, por lo cual resulta indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo como fuente de energía y reguladores osmóticos. La sacarosa es el azúcar empleado universalmente. Le siguen en importancia glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa entre otros. ===Vitaminas=== hidrógeno Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalíticas en el metabolismo y son requeridas en pequeñas cantidades. Las vitaminas más empleadas son:

  • [[Tiamina (vitamina B1): se añade como hidrocloruro de tiamina y constituye una vitamina esencial para el crecimiento de células vegetales. Es un coenzima de la descarboxilación de los cetoácidos piruvato y œ-cetoglutarato y es esencial para el crecimiento radical pues interviene en la síntesis de citocininas.
  • Ácido Nicotínico: forma parte de las coenzimas NAD y NADP que intervienen en la transferencia de hidrógeno, además de ser precursor el triptófano y por tanto tiene un efecto sinérgico con el AIA en la producción de raíces y ejerce acción inhibitoria en el desarrollo de yemas axilares.
  • Piridoxina (Vitamina B6): Es añadida como hidrocloruro de Piridoxina (Piridoxina-HCl). Participa como coenzima en el metabolismo de los aminoácidos, entre ellos el triptófano, precursor de AIA y ácido nicotínico, además de favorecer la formación de raíces.
  • Myo-inositol: No es propiamente una vitamina, sino un azúcar-alcohol. Tiene un efecto sobre la proliferación de tejidos y sobre la activación de la organogénesis.
  • Ácido ascórbico y ácido cítrico: Son añadidos a los medios de cultivo en ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes para evitar el oscurecimiento de determinados tejidos.

Aminoácidos y extractos naturales

Los aminoácidos favorecen la proliferación de callos y la organogénesis. Los efectos obtenidos mediante el aporte de aminoácidos parecen muy variables según la especie y el tipo de morfogénesis estudiada. Dentro de ellos se encuentran la glutamina, L-arginina, L-cisteína entre otros.
Los extractos naturales estimulantes son numerosos productos de composición variable y no bien definida. Dentro de ellos se encuentran extracto de levadura, hidrolizado de caseína, peptona y agua de coco (más utilizado) entre otros.


Agua de coco

El endospermo líquido de coco (agua de coco) se utiliza como un suplemento de medios de cultivo estándar, corrige deficiencias de molibdeno, manganeso y cobre. Dentro del campo del cultivo in vitro, su uso es de vital importancia para la inducción de la división celular en tejidos diferenciados.

En el coco una gran cantidad de endospermo líquido se desarrolla precozmente, y sirve para almacenar nutrimentos para el embrión en desarrollo, mientras el embrión se mantenga latente, el endospermo líquido inducirá la división celular.


Composición del agua de coco. El agua de coco (AC) es un medio muy complejo, con una amplia gama de componentes orgánicos e inorgánicos; tiene buena capacidad de amortiguación (buffer) y no es raro encontrar sales en ella. Es rica en potasio, magnesio y fosfato, el contenido de azúcar está alrededor del 2%. Adicionalmente se encuentra en ella nitrógeno no proteínico soluble en forma de aminoácidos; pero su uso se justifica no solo por su excelente capacidad amortiguadora sino también por sus cualidades promotoras del crecimiento, en su totalidad son superiores a las de otros medios conocidos. Además, en aquellas áreas, donde crece el coco es significativamente más barato que los compuestos purificados o sintéticos tales como la zeatina o el inositol.

Composición del agua de coco por 100 g

Fuente: CIAT – JICA, 1994














Algunos componentes orgánicos del agua de coco

Fuente: Roca et. al. (1991)







Usos en cultivo de tejidos. Se ha demostrado que el agua de coco es útil para estimular la proliferación de retoños en muchas especies de plantas. El agua de coco debe ser preparado de los cocos seleccionados filtrados y esterilizados para su utilización, debe usarse agua de coco a una concentración de (5% – 20% v/v).

Una gran parte de los trabajos realizados sobre cultivo de tejidos ha girado alrededor del uso del AC en presencia o ausencia de AIA, ANA ó 2,4-D. En caso de los tejidos recalcitrantes, se debería ensayar también una amplia gama de otros compuestos conocidos por sus propiedades estimuladoras de crecimiento.

Aunque todavía no se conocen completamente todas las fracciones del agua de coco, se sabe bastante sobre ellas. Llegará el día en que este líquido nutritivo sea remplazado por un medio completamente identificado; mientras tanto, su uso se justifica, no sólo por su excelente capacidad amortiguadora sino también porque sus cualidades promotoras de crecimiento frecuentemente son superiores en su totalidad a las de otros medios conocidos.

El agua de coco tiene un amplio uso en medios de cultivo de caña de azúcar, en esta sustancia se ha encontrado reguladores de crecimiento: auxinas y giberelinas, las cuales están en menor concentración que las citoquininas.

Preparación y conservación. Se prepara a partir de cocos seleccionados y se procesa para eliminar la mayor parte de las proteínas. A continuación, el producto se esteriliza por filtración y se congela antes de su envío. Los niveles de proteína remanentes en el agua pueden variar de un lote a otro y pueden resultar en un precipitado cuando el producto se congela. Esta precipitación no debería afectar el crecimiento del tejido vegetal. El precipitado se puede eliminar filtrando o dejándolo asentarse en el fondo de la botella y luego decantando. El agua de coco se puede dividir en alícuotas más pequeñas, correspondientes a su tamaño de lote medio estándar, y volver a congelar hasta que se necesite. Se conserva a -20ºC.


Agentes gelificantes

El agar se ha convertido en el material de soporte más ampliamente usado, pues provee el medio de un excelente gel húmedo que sirve como soporte al explante. También es utilizado el gelrite o fitagel.

Agua

Es de vital importancia la calidad del agua empleada para realizar los medios de cultivo la cual debe ser destilada. Siempre que se realicen trabajos con cultivo de tejidos y células in vitro el agua a usar debe tener la mayor calidad posible (desionizada), debiendo estar entre 0.5 a 2 mS/ cms.


Reguladores del crecimiento vegetal

Los reguladores del crecimiento vegetal se agrupan en cinco categorías: auxinas, citokininas, giberelinas ácido abscísico y etileno. Además de estas sustancias naturales de la planta existen otros productos que pueden utilizarse como reguladores del crecimiento para el cultivo in vitro.
Principales reguladores del crecimiento empleados en cultivo de tejidos.

AUXINAS

CITOKININAS

GIBERELINAS

ETILENO
ACIDO ABSCISICO
POLIAMINAS

BRASINOESTEROIDES

OLIGOSACARINAS

Fuentes

  • Ewind G., Hall M. and Klerk D. 2008. Plant Propagation by tissue culture Volume 1. Ed. Klerk.
  • Krikorian A. D. 1991. Medios de cultivo: generalidades y preparación Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos. Embriogénesis somática y organogénesis. En: Roca, WM y Mroginski LA (eds). Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. CIAT, Cali pp 41-59.
  • Litz RE & Jarret RL. 1991. Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos. Embriogénesis somática y organogénesis. En: Roca, WM y Mroginski LA (eds). Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. CIAT, Cali pp 143-172
  • Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15: 473-497.
  • Roca, WM. y Mroginski, LA. 1991. Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. Cali, Colombia. CIAT. 970p.
  • Llanqui Velasco E. 2011. Efecto del agua de coco en la micropropagación del Plátano (Musa AAB) y Banano (Musa AAA) en medios de cultivo sólido y líquido. Tesis de Grado presentado para optar por el Título de Ingeniero Agrónomo. La Paz – Bolivia. 94pp
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