Cinética de degradación del naftaleno

Cinética de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de bacillus alcalophilus cepa IDO-225 strain

Numerosas han sido las investigaciones sobre el estudio de la biorremediación para su aplicación en la lucha para combatir la contaminación ambiental por hidrocarburos. El Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Ambiente, ha trabajado de 1988 en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar el petróleo. En la actualidad, cuenta con cuatro bioproductos degradadores de petróleo en medio marino denominados BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC e IDO-225. En el presente trabajo, se demuestra por Espectroscopía Infrarroja de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de contacto de las células húmedas inmovilizadas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 en el medio de degradación con el naftaleno, un hidrocarburo del petróleo, que estás son capaces de degradar el naflateno como única fuente de carbono y energía.  Las células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 son capaces de utilizar el naftaleno como única fuente de carbono y energía.
El mecanismo propuesto para oxidación del naftaleno se basa en la metil-oxidación y en la -oxidación.

La biorremediación

La biorremediación es la adición de materiales a medio ambientes contaminados para acelerar los procesos de biodegradación natural.1 Es conocida como el principal proceso natural para eliminar del medio ambiente las fracciones no volátiles del petróleo, por lo que permite reducir notablemente las concentraciones de petróleo residual. 2 Esto contribuye de modo muy efectivo a que se garantice una rápida y adecuada recuperación del área impactada por el derrame.3
La biodegradación microbiana es un proceso lento, que está determinado por numerosos factores como la concentración y estructura química de las sustancias a degradar, tipo y concentración de microorganismo y factores físicos y químicos.4,5
Las condiciones ambientales desfavorables influyen en el desarrollo de los microorganismos degradadores. Entre estas condiciones ambientales están: las bajas temperaturas existentes en el mar, la alta salinidad, la cual influye en la permeabilidad de la membrana celular, las bajas concentraciones de nutrientes, específicamente nitrógeno y fósforo, así como bajas concentraciones de oxígeno disuelto. 6
Las características moleculares del hidrocarburo son un factor importante a tener en cuenta, ya que determinan la solubilidad del hidrocarburo en agua y definen la velocidad y los mecanismos de ataque del microorganismo. El número de átomos de carbono, las ramificaciones, los anillos (aromáticos o no, su número y ubicación) y la presencia de sustituyentes, confieren ciertas particularidades a algunas etapas del proceso de biotransformación para determinados hidrocarburos. 7
En el caso de los hidrocarburos aromáticos, que comprende al benceno (C6H6) y sus homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es saturada. Al producirse la oxidación del anillo, éste se abre por un doble enlace y se obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes productos intermedios. 8
El Instituto de Oceanología trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas degradadoras de petróleo y cuenta con un bioproducto llamado BIOIL formado por cepas del género Bacillus, capaces de llevar a cabo la degradación de hidrocarburos con gran eficiencia y tiene la ventaja de no incluir nutrientes en su formulación. 9 De las cepas integrantes de este bioproducto, se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que la cepa IDO-225 es la responsable del alto porcentaje de actividad, razón por la cual fue la escogida para el desarrollo de este estudio.

Materiales y métodos

Microorganismo empleado
El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa IDO-225, aislada de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas11 perteneciente a la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del Instituto de Oceanología.
Medios de Cultivo
Para la conservación del Bacillus alcalophilus se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según Gorbienko12 y la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana se realizó según Núñez.13
En la degradación de naftaleno por las células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se empleó un medio que contenía naftaleno (30 g/L) disueltos en 1L de agua de mar. 9, 13
Obtención del bioproducto inmovilizado
Para obtener la biomasa, el cultivo se sedimentó a 700 xg en una centrífuga refrigerada Berkman (USA). Las células fueron inmovilizadas por atrapamiento en gel según la metodología descrita por Bellota. 9
Evaluación de la capacidad degradadora de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225
Se realizó un experimento por bloques completamente aleatorizado, con las células de IDO-225 inmovilizadas húmedas en el medio de degradación.
La capacidad degradadora se determinó inoculando 0.5 g de cada bioproducto en frascos Erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 50 mL de medio de degradación. Como control se utilizó medio de cultivo estéril. Los experimentos se realizaron en zaranda orbital rotatoria Infors (Suiza) a125 r/min y 30 ºC durante15 días.
Se tomaron muestras cada 3 días para la determinación de la concentración de hidrocarburos según Dubois.14
Estudio del posible mecanismo de degradación
El hidrocarburo residual y el resto de los componentes orgánicos del proceso fermentativo fueron recuperados cada 3 días mediante tres extracciones sucesivas con 50 mL del solvente (CCL4) (1:1) (v/v) en la fase orgánica, las cuales fueron posteriormente deshidratadas con Na2SO4. El análisis cualitativo y cuantitativo de los hidrocarburos de la fase orgánica se realizó por espectroscopía infrarrojo en un Konik de fabricación norteamericana.
Tratamiento estadístico de los resultados
Para el procesamiento estadístico de los resultados se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple 15 y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan. 16 Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1.

Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1

Figura 1. Consumo de naftaleno por las células inmovilizadas húmedas de B. alcalophilus en medio de degradación.

La curva de concentración de naftaleno (Fig. 1) muestra la transformación de este sustrato por el microorganismo inmovilizado. Los niveles de este hidrocarburo disminuyeron rápidamente en los primeros 6 días, posteriormente continúan disminuyendo lentamente alcanzando un alto porcentaje de remoción al final del proceso.
Tabla 1. Modelos cinéticos de degradación de naftaleno por células libres e inmovilizadas de Bacillus alcalophilus donde C representa la concentración de naftaleno en g/L.

Modelo cinético de degradación R2
Células libres dC/dt = -0.0693C2+0.5366C-0.8 0.9620
Células inmovilizadas dC/dt = -0.0580C2-0.2667C+0.3 0.9770

El modelo cinético de segundo orden obtenido durante el proceso de biodegradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 (Tabla 1), según Head17 y Núñez18, se corresponde con un mecanismo de metil-oxidación representado por el coeficiente del término cuadrático y una -oxidación por el coeficiente del término de primer orden.
Según los resultados, el modelo cinético y la velocidad a la que ocurrió el proceso, es poco probable que ocurran mecanismos de -oxidación y -oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos.17
El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación. Al comparar los modelos cinéticos de segundo orden de la degradación de naftaleno por células inmovilizadas húmedas y células libres19 de Bacillus alcalophilus (Tabla 1), es necesario mencionar que en el caso de las células inmovilizadas pueden obtener energía suficiente y fácilmente para el mantenimiento celular a través de la metil-oxidación, por esta razón en el modelo cinético de esta variante el término cuadrático es mayor. Sin embargo en las células libres19 se observó que el coeficiente correspondiente a la -oxidación es mayor que en las células inmovilizadas, porque se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación acompañado de un gran requerimiento energético.17
Mediante el mecanismo de -oxidación de naftaleno por células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se obtiene acetil-CoA, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.20
El paso determinante en la velocidad de degradación del naftaleno es la metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo (Tabla 1) es mayor en las células inmovilizadas con respecto a las células libres19, por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus es mayor en el caso de las células inmovilizadas húmedas.
Esto se debe a que las células libres, necesitan no sólo de fuente de carbono, sino de otros nutrientes para poder llevar a cabo sus procesos metabólicos. Sin embargo cuando están inmovilizadas, se encuentran en un estado de no crecimiento, ya que el medio se encuentra desbalanceado, ocurriendo la transformación del sustrato por un mecanismo de bioconversión donde la célula transforma el sustrato y además, obtiene la energía de mantenimiento a partir de la fuente de carbono.10
Resultados similares fueron obtenidos por Omar21 en 1990 cuando lograron un 30 % de degradación de crudo con Candida parapsilosis inmovilizada en arcilla en 4 semanas y sin embargo con células libres necesitaron 8 semanas para alcanzar igual nivel de degradación.

Bibliografía

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Núñez,R.R.*; Cabranes, Y.*; Ortiz, E.*; Gondres, R.**; Martínez, C.*; Martínez, J.

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