Contaminación microbiana in vitro (Tejidos vegetales)

Contaminación microbiana in vitro de tejidos vegetales Concepto: La contaminación de fuentes fundamentales: microorganismos y manipulación de los operadores en los laboratorios.

Contaminación microbiana in vitro de tejidos vegetales. La contaminación en el cultivo de tejidos puede originarse de dos fuentes fundamentales: una llevada a cabo por microorganismos en la superficie o en los tejidos de los explantes, o por deficiencias en la manipulación de los operadores en los laboratorios.

Durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, la superficie y la rizosfera están habitadas por microorganismos que pueden entrar al tejido a través de aberturas naturales, heridas, oportunistamente, y llegan a colonizar los tejidos vegetales.

Influencia de los microorganismos en el cultivo in vitro

Los principales microorganismos asociados con la superficie de las plantas son: hongos, levaduras, bacterias, spiroplasmas y micoplasmas. Las áreas donde se concentran mayor cantidad de nutrientes en la superficie de las plantas son: néctar, ceras, tejidos senescentes, etc. Las poblaciones de hongos y bacterias pueden desarrollarse en residuos de insectos, además, las hendiduras, pelos densos y superficies mucilaginosas pueden albergar microorganismos.

Contaminación de las plantas madres

Constituye la mayor fuente de contaminación en el cultivo de tejidos. Puede ser más fácil detectar contaminantes en los tejidos maduros de las plantas donantes cuando hay expresión de síntomas y/o altas poblaciones, que en el cultivo in vitro donde sus manifestaciones y poblaciones pueden estar suprimidas.

Contaminantes microbianos introducidos en el laboratorio

Los microorganismos que se introducen en el laboratorio son generalmente habitantes del suelo que se encuentran en el ambiente; saprofitos o patógenos de las plantas, así como habitantes de la microbiota normal del cuerpo humano que se relacionan con procederes inadecuados en el laboratorio, condiciones higiénico sanitarias deficientes o incumplimientos de la disciplina tecnológica.

Ciertas bacterias entran al cultivo de tejidos con los explantes iniciales pero otras son claramente introducidas en el laboratorio. Entre los hongos filamentosos contaminantes, los géneros encontrados con mayor frecuencia han sido Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, Alternaria yNeurospora.

Las bacterias son consideradas como los contaminantes más comunes y las que ocasionan los problemas más serios, porque pueden ser sistémicas, y su detección es más difícil.

Detección e identificación de microorganismos contaminantes

Los contaminantes fungosos no son difíciles de detectar en el medio de cultivo pues su crecimiento es visible en forma de colonias aisladas o alrededor de los explantes. Los caracteres culturales de su crecimiento no difieren del observado en medios de cultivos micológicos.

Las bacterias también crecen superficialmente en el medio del cultivo de las plantas, alrededor de los explantes y dentro del propio medio de cultivo; si están asociadas al tejido vegetal no se distinguen colonias aisladas sino una masa bacteriana en forma de pliegues, halos o rosetas en el interior del medio sólido y se aprecia abundante y escaso crecimiento sobre la superficie. En el medio líquido forman turbidez uniforme o no, películas o sedimento.

La afirmación de que los cultivos están libres de contaminantes por apreciación visual de la ausencia de crecimiento bacteriano en el medio puede conducir a certificaciones erróneas. Las bacterias en ocasiones a diferencia de otros microorganismos no producen crecimiento visible hasta mucho tiempo después de que fueron introducidas.

Las altas presiones osmóticas, el pH y determinadas hormonas pueden inhibir o limitar el crecimiento bacteriano. Se ha comprobado que las citoquininas ejercen un efecto bacteriostático sobre ellas.

Por estas razones se precisa de métodos de detección rápidos y seguros, como la transferencia de fragmentos del material vegetal a medios bacteriológicos donde crecen varios representantes de este grupo o también se utilizan componentes de medios bacteriológicos en el medio de cultivo de plantas y el empleo de métodos turbidimétricos.

Métodos de identificación de contaminantes

Para la identificación de contaminantes generalmente se emplean los métodos tradicionales auxiliados de los manuales de clasificación correspondientes, aunque existen modernas técnicas como el análisis de ácidos grasos, PCR, RFLP y AFLP que se incorporan para microorganismos específicos de un cultivo. Es importante estudiar y determinar la microbiota específica de un laboratorio, biofábrica o país para poder diseñar los métodos de detección y control en función de esto.

Principales fuentes de contaminación

La contaminación microbiana es un problema multicasual y la determinación de la fuente que la origina se dificulta a menudo ya que los microorganismos pueden ser introducidos en varios puntos del proceso productivo, principalmente, por ineficiente desinfección de los explantes primarios utilizados en la fase de establecimiento, por inadecuada manipulación del material vegetal, deficientes técnicas de asepsia, incompleta esterilización del medio de cultivo, por fallos en el funcionamiento del flujo laminar, o a través del ambiente de los locales de trabajo. Además, pueden diseminarse en las habitaciones por ácaros, trips y hormigas.

El explante

En dependencia del tipo de explante utilizado los microorganismos superficiales o endofíticos de las plantas pueden ser introducidos al cultivo in vitro. Con el cultivo de meristemos, pueden ser eliminados muchos de ellos pero en explantes de hojas, peciolos o tallos en su mayoría pueden ser introducidos.

Los métodos de desinfección utilizados no siempre eliminan las poblaciones de microorganismos asociados a los tejidos de las plantas, muchos son capaces de permanecer latentes en el interior de las células, en los espacios intercelulares o en los haces conductores y quedan protegidos de los agentes químicos. De esta forma se introducen en el cultivo de tejidos, se propagan con el material vegetal y pueden manifestarse sobre los medios de cultivo en la fase de establecimiento o permanecer sin expresarse por largos períodos de tiempo.

El ambiente

El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminación ya sea directa o indirectamente. A través de las corrientes de aire las partículas de suelo cargadas de esporas son arrastradas y penetran a los locales por los acondicionadores de aire; son transportadas o introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones higiénicas inadecuadas.

Para realizar el cultivo de tejidos se requiere del mantenimiento de condiciones asépticas. El uso de aires acondicionados domésticos, los cuales intercambian constantemente aire con el ambiente, elevan las probabilidades de entrada de microorganismos. Es importante el estricto mantenimiento de la limpieza para disminuir la carga microbiana ambiental, así como la organización adecuada del proceso productivo.

El hombre

El hombre interviene directamente en todas las operaciones y es una fuente primaria de contaminantes a través del estornudo, la tos, la conversación, etc. La presencia de microorganismos contaminantes que son habitantes de la microbiota normal del cuerpo humano como por ejemplo: Staphylococcus epidermidis o Candida albicans, generalmente indican ineficientes técnicas de asepsia por parte de los operarios.

En el trabajo dentro de la cabina del flujo laminar es donde el operario puede introducir la mayoría de los microorganismos. Incumplimientos de la disciplina tecnológica contribuyen al incremento de la contaminación y llegan a ocasionar pérdidas muy costosas. Juega un papel importante el personal técnico y auxiliar que labora en la limpieza y fregado de frascos, en la preparación y esterilización del medio y en el control de la calidad.

Los equipos y el instrumental

La esterilización por calor húmedo en autoclave se emplea comúnmente para eliminar los microorganismos de los medios de cultivo, de la calidad de este paso depende en gran medida la continuidad del proceso. Los problemas en la esterilización pueden deberse a fallos en los funcionamiento de las autoclaves o a errores en su manipulación.

Determinados microorganismos son particularmente introducidos por esta vía, como por ejemplo: el género Bacillus, que puede contaminar los medios por insuficiente esterilización o mal funcionamiento de las autoclaves y puede ser diseminado durante las operaciones con el material vegetal.

Las colonias bacterianas pueden detectarse dentro del medio a partir de las 24 horas de preparado y luego emergen a la superficie ocasionando daños severos a las plantas. Esta problemática es muy común en las biofábricas, de ahí la importancia de mantener en reposo los medios de cultivo por 24-72 horas para verificar la calidad de la esterilización. La cabinas de flujo laminar si funcionan adecuadamente proporcionan condiciones de asepsia para el trabajo en biotecnología vegetal, pero esto depende en gran medida del uso, cuidado y revisión periódica de los filtros.

Los equipos destinados al tratamiento de agua (desionizadores, destiladores, etc.) también pueden introducir contaminación; por fallos en el mantenimiento o procederes inadecuados, en sus resinas pueden abrirse oquedades donde los microorganismos, principalmente bacterias, se sitúan y multiplican.

En los laboratorio con clima centralizado, estos equipos también pueden introducir y diseminar contaminación. Cuando se combinan la limpieza ineficiente de los cuartos con la existencia de focos contaminantes y se producen fluctuaciones de temperatura; en los conductos de aire hongos filamentosos como Cladosporium sp. se pueden multiplicar y esparcir. Además, los instrumentos utilizados se esterilizan con calor seco o se flamean en alcohol, pero si esto no se hace por el tiempo suficiente las esporas de Bacillus spp. pueden sobrevivir y contaminar los cultivos.

Los insectos

Una rápida aparición de contaminantes fúngicos en muchos frascos a la vez dentro de una cámara de cultivo puede ser evidencia de la presencia de ácaros, trips u hormigas, que aunque no provocan graves daños a las plantas sirven como vectores para esparcir la contaminación.

Infestaciones por ácaros y trips han causado la pérdida total del material vegetal en varios laboratorios de cultivos de tejidos pues por su pequeño tamaño penetran en los recipientes sin ser detectados, y lo que se observa es un crecimiento fungoso sobre el medio de cultivo. Además de las esporas de hongos, los ácaros pueden llevar sobre su superficie bacterias tales como Erwinia spp. los trips tienen una corta vida y pueden completar su ciclo en tres semanas. Se han encontrado in vitro ácaros de los géneros Tyrophagus, Siteroptes y Pyemotus y trips de los géneros Thrips, Allelothrips y Frankliniella.

Efecto de los diferentes microorganismos

Hongos filamentosos y levaduras

La mayoría de los hongos y levaduras aislados del cultivo de tejidos de plantas pertenecen a géneros y especies que están ampliamente distribuidos y pueden encontrarse en edificaciones, ambientes externos, en el aire de los laboratorios y como saprofitos o patógenos en la superficie aérea de las plantas en el campo.

En el caso de estos microorganismos no se mantienen latentes en el cultivo de tejidos; muchos de ellos son considerados patógenos in vivo y también pueden causar daños en el cultivo de tejidos por parasitismo directo.

Algunos hongos patógenos como Botrytis, Alternaria, Penicillium y Aspergillus han sido capaces de crecer inicialmente en el medio sin plantas, y lograr su establecimiento posterior en el tejido de éstas, después que el metabolismo y crecimiento de las mismas disminuyó.

Los hongos y levaduras aparecen en los cultivos de tejidos más viejos, los cuales han estado visiblemente libres de contaminantes durante meses o años. Estos microorganismos pueden ser aislados al azar, del aire de los laboratorios, de medios vertidos sin plantas y de cultivos de tejidos que han estado in vitro por más de un año.

Existe una estrecha correlación entre las especies y géneros de hongos y levaduras encontradas en el aire del laboratorio, los medios vertidos sin plantas y los cultivos viejos, que indica que la fuente de mayor contaminación fúngica es el aire del laboratorio, y que los hongos y levaduras pueden ser introducidos por manipulación después del autoclaveo. Se plantea que tales microorganismos no han sido hallados de forma latente en el cultivo de tejidos y que esta contaminación llega a su punto máximo durante los meses de altos contenidos de esporas en el aire externo y en el laboratorio.

En muestreos realizados en laboratorios de tres países europeos el 40 % de las levaduras encontradas fueron Candida guilliermondiilfamata o Candida parapsilosis, el 20 % otras Candida spp. y el 40 % Rhodotorula spp.; de los hongos filamentosos el 35 % fueron Penicillium spp, el 17 % Aspergillus, el 8 % Alternaria y el 8 % Fusarium spp.

Se plantea que existen tres posibilidades para los hongos del aire exterior que entran con el frasco de cultivo dentro del flujo laminar":

• Los contaminantes pueden ser introducidos si los operadores trabajan muy cerca del borde de la cabina del flujo laminar. Esto fue corroborado por los hallazgos donde los contaminantes se aislaron del aire entre los 15-20 cm de la cabina, allí los cultivos de Hosta indexados negativamente, que fueron subcultivados cerca del borde de la cabina, se contaminaron a una proporción mayor que cuando se hizo dentro de ésta (más profundamente).

• Los frascos de cultivo en la mayoría de los laboratorios tienen depósitos de polvo visibles en la tapa y en la superficie, a partir de los cuales las poblaciones fungosas y de levaduras similares a las del aire pueden ser aisladas. Las esporas de hongos y las células de las levaduras en el polvo, pueden ser introducidas mediante el flujo del aire en la cabina, cuando los frascos se abren.

• Los operadores han encontrado que las esporas de Penicillium y Botrytis cinerea que se establecen en la tapa del frasco, pueden germinar en la película de agua de condensación (que a menudo se forma sobre el borde del frasco) y desarrollarse activamente en el interior del mismo.

• Un estallido repentino de hongos y levaduras como contaminantes asociados con infestación de ácaros y trips ha causado grandes pérdidas en los lugares infectados. Estos organismos pueden penetrar en la mayoría de los pomos de cultivos y crear grandes problemas, principalmente por introducción de hongos y levaduras dentro del cultivo de tejidos, por lo que son considerados “vectores de contaminación”.

Bacterias

La mayoría de las bacterias aisladas como contaminantes del cultivo de tejidos son especies que no se conocen como patógenos de plantas in vivo. A diferencia de los hongos y levaduras, estas bacterias no producen crecimiento visible en el medio o síntomas en las plantas hasta un tiempo después de haber sido introducidas dentro del cultivo de tejidos. Esta habilidad para establecerse latentes hace que sea difícil inferir la fuente de contaminación así como el momento en que las bacterias son detectadas en las plantas.

Muchas de ellas son introducidas con el explante, mientras que otras son claramente introducidas en el laboratorio durante el subcultivo. Gran parte de las bacterias aisladas de la superficie de la planta son saprofitos, pero muchas poblaciones de ciertas bacterias fitopatógenas pueden estar presentes como epifitos sobre plantas aparentemente sanas.

La desinfección de la superficie del explante antes de su colocación en el medio puede ser ineficiente y dar lugar a la contaminación inicial en el medio. Las observaciones microscópicas de la superficie aérea de la planta revelan que las bacterias en este lugar no son necesariamente ni espacial, ni uniformemente distribuidas y muchas pueden ser agregadas alrededor de ciertas características morfológicas sobre la superficie.

Ciertas bacterias se han reportado como que viven endofíticamente o que son patógenos latentes. Pocos estudios están disponibles sobre la demostración de poblaciones de bacterias internas no patogénicas que están en los tejidos que son tomados como explantes (brotes jóvenes, fracciones de tallos, nudos, yemas florales y meristemos).

Según estudios realizados, el 30% de aislados bacterianos a partir de explantes fueron pseudomonas fluorescentes, el 24% pseudomonas no fluorescentes, el 16% Agrobacterium spp. y el 10% Erwinia spp. Es razonable que los miembros de las familias Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae son contaminantes tempranos del cultivo de tejidos porque son a menudo las bacterias dominantes asociadas con la superficie aérea de las plantas desarrolladas bajo condiciones de campo. Cuando no se observa crecimiento bacteriano en las etapas 1 y 2 o en el medio, se tiende a considerar que la contaminación observada después en el cultivo, fue introducida durante los subcultivos siguientes.

Muchos de los contaminantes encontrados en cultivos viejos están asociados con el ambiente humano o del laboratorio. Staphylococcus epidermidis se ha encontrado como contaminante de varias especies, pues es un habitante de la piel humana y de otros tejidos. Se han detectado Staphylococcus y Micrococcus spp. en las muestras de aire del laboratorio, así como Bacillus spp. en medios vertidos manualmente.

Es probable que Bacillus spp. sea introducido en los cultivos de tejidos como resultado de las prácticas de laboratorio incorrectas. Sus células producen endosporas resistentes al calor capaces de sobrevivir temperaturas de 100oC o más, y son resistentes a muchos biocidas (alcohol, hipoclorito, cloruro de mercurio). Sus esporas se encontraron sobreviviendo en el alcohol utilizado para la desinfección de instrumentos; si estos no se esterilizan al calor suficientemente después de su inmersión en alcohol, la bacteria puede ser diseminada a cultivos limpios.

Bacterias fastidiosas, virus y tiroides

Las bacterias fastidiosas (micoplasmas, spiroplasmas y ricketsias), los virus y viroides son patógenos obligados de plantas y no pueden persistir (o sólo por períodos limitados de tiempo) fuera de sus plantas huéspedes y animales vectores.

Algunas especies pueden ser transmitidas manualmente y por ácaros y trips, que son descritos como vectores de hongos, levaduras, bacterias, virus y micoplasmas in vivo. No existen evidencias de la introducción de estos organismos por operadores o vectores en el laboratorio, se plantea que estos microorganismos son introducidos con el explante inicial.

Efecto de las condiciones ambientales y la fisiología de las plantas

La mayoría de los microorganismos contaminantes son “vitropatógenos”, es decir, organismos patogénicos a plantas in vitro pero no patogénicos a plantas crecidas en campo. Algunos son conocidos como saprofitos en la superficie de las plantas, pero una gran cantidad forma parte de la microflora normal de las partes aéreas de la superficie de las plantas, los cuales son normalmente los tejidos que más se toman como explantes.

Estos organismos generalmente se convierten en patogénicos en el cultivo de tejidos porque las condiciones ambientales y la fisiología de las plantas son diferentes in vitro. Los medios de cultivo de tejidos contienen todos los nutrientes minerales esenciales para las plantas en concentraciones que son de 3 a 20 veces superiores a las encontradas en los medios usados para cultivo en hidropónicos in vivo.

Estos medios también contienen altas concentraciones de azúcar y otros nutrientes orgánicos; el azúcar es adicionado para permitir un rápido crecimiento heterotrófico de las plantas ya que la generación de energía y carbohidratos por fotosíntesis, es muy baja en la mayoría de las cámaras de crecimiento. En la superficie de las plantas in vivo y en los hidropónicos, el crecimiento de todos los microorganismos heterotróficos es pobre, debido a la disponibilidad limitada de mono y oligosacáridos y ácidos orgánicos.

Sin embargo, por la adición de azúcar y otros compuestos orgánicos, el medio de cultivo se convierte en un buen sustrato para el desarrollo de hongos, levaduras y algunas especies de bacterias.

La desinfección de la superficie de las plantas no elimina solamente a los microorganismos que pueden convertirse en patógenos in vitro, sino también a la microflora antagonista que evita el establecimiento de otros saprofitos y algunos microorganismos patógenos, y en algunos casos protege a las plantas contra ciertas enfermedades del campo. El uso de microorganismos benéficos se ha sugerido como un método alternativo para el control de la contaminación.

A causa de la respiración de las plantas y la evaporación del medio, la humedad relativa dentro de los frascos de cultivo es aproximadamente 95 %. Esto resulta favorable para el desarrollo de muchos hongos, levaduras y bacterias, y es muy diferente a la situación en el campo y en las casas solares, donde la humedad relativa es muy variable y sólo permite un cierto rango de microorganismos en la superficie de las plantas. Producto de la alta humedad en la mayoría de los frascos de cultivo, los estomas permanecen abiertos y hay una constante presencia de agua en la superficie de las plantas.

La alta humedad relativa puede ser la causa de la falta de ciertos caracteres fisiológicos que proporcionan el crecimiento de los tejidos más viejos en el campo con resistencia pasiva u horizontal al ataque por microorganismos. En estudios realizados, la mayoría de las especies de plantas, han mostrado muy poca lignificación o muy poco o ningún desarrollo de la cera subcuticular comparada con el crecimiento de las plantas en invernaderos o en las cámaras de crecimiento.

La alta humedad y la ausencia de lignificación y capa de cera muestran que el crecimiento de plantas en campo o casa de cristal es más susceptible al ataque microbiano. Y esto se extrapola en el sentido de sugerir que las plantas de cultivo de tejidos son más susceptibles a patógenos. Sin embargo, esto no es totalmente cierto, pues existen evidencias crecientes de que al menos algunas especies de plantas tienen un mecanismo in vitro de resistencia adicional o más activa.

Eliminación de los contaminantes de los explantes

La mayoría de los esfuerzos en este aspecto han estado concentrados en la prevención y tratamiento de los contaminantes que son introducidos con los explantes tomados de las plantas in vivo. Los tres puntos fundamentales hacia los que debe estar dirigido el control y prevención de los contaminantes son:

• Tratamiento a las plantas madres.
• Desinfección de los explantes.
• Detección de contaminantes latentes.

Tratamiento a las plantas madres

Las plantas madres deben mantenerse libres de enfermedades por estrictos métodos de control biológico y químico. El número de bacterias y hongos en el tejido aéreo de las plantas usadas como explantes debe ser reducido mediante el mantenimiento de éstas lo más secas posibles en casa de cristal. El tomar explantes de órganos subterráneos de la planta, de muy cerca del suelo o de plantas con riego excesivo, reduce la eficiencia de los subsecuentes procesos de desinfección.

Los explantes que usualmente son tomados de tejidos aéreos jóvenes de las plantas (meristemos, nódulos, botones florales, discos de hojas, anteras, polen, etc) están por lo general libres de poblaciones internas detectables de viroides, virus, micoplasmas, bacterias y hongos.

Desinfección de los explantes

Los contaminantes microbianos en la superficie de los explantes son generalmente eliminados por la inmersión de estos en un amplio espectro de biocidas tales como: hipoclorito, alcoholes, cloruro de mercurio u otros productos químicos con actividad más selectiva como son los fungicidas, insecticidas y antibióticos.

La mayoría de los biocidas de amplio espectro son no sistémicos, pero los explantes mueren si se les permite que penetren en sus tejidos internos. El éxito de la desinfección utilizando estos compuestos está en que el tejido interno de la planta esté libre de microorganismos contaminantes, sin embargo, si este está infestado por hongos, bacterias, micoplasmas, virus o viroides, estos son inevitablemente transferidos al cultivo de tejidos.

En estudio realizado se ensayó un método físico de separación de microorganismos de las células y protoplastos mediante un gradiente de centrifugación de la sucrosa. Posteriormente se planteó que este método puede ser combinado con diluciones de hipoclorito y/o tratamientos antibióticos de las células antes y después de la centrifugación con muy buenos resultados.

Detección de contaminantes latentes

Los explantes tomados de las plantas madres deben ser testados para la presencia de contaminantes latentes en todos los subcultivos al menos seis meses después de la desinfección, y testados para las bacterias vitropatógenas a intervalos regulares de dos a tres meses. Nuevas contaminaciones bacterianas son permanentemente introducidas en el laboratorio.

En la mayoría de los laboratorios el test de rutina para bacterias latentes se lleva a cabo mediante transferencias del material de la planta y/o el uso de medios de cultivo de tejidos con “test de esterilidad bacteriológica” o “medios index”. El uso de medios bacteriológicos tiene la ventaja de que estos permiten el crecimiento y detección de un amplio rango de especies bacterianas que causan severos daños en el cultivo de tejidos de plantas.

Sin embargo, tienen algunas limitaciones como que las bacterias con requerimientos nutricionales especiales no crecen en los medios de rutina, en las etapas 1 y 2 de los index los residuos de desinfectantes pueden inhibir el crecimiento del material vegetal y con ello prevenir el crecimiento y detección de bacterias, además, algunas bacterias necesitan estar en un elevado número para que se expresen en el index, los materiales de algunas plantas pueden excretar sustancias antimicrobianas y la mayoría de los micoplasmas, spiroplasmas y rickettsias no crecen en medios comunes.

Los micoplasmas, virus y viroides pueden ser detectados solamente mediante inoculación de plantas indicadoras y/o con el uso de métodos serológicos, microscópio electrónico o hibridización de ácidos nucleicos.

Prevención y tratamiento de la contaminación en el laboratorio

En el cultivo de tejidos de plantas comercial, la prevención y tratamiento de la contaminación ha conducido a la implementación de sistemas detallados de control de la producción microbiológica en un intento de prevenir la contaminación mediante el monitoreo y control de todas las posibles fuentes de contaminantes.

Los parámetros probados y los métodos microbiológicos utilizados son similares a los empleados en otras industrias que elaboran productos asépticos o libres de contaminación, esto incluye:

• El monitoreo de diferentes fuentes de contaminación mediante el testaje regular del aire del laboratorio, la esterilidad del medio preparado y el funcionamiento de autoclaves, flujos laminares e instrumentales, además, la determinación de tasas de contaminación por línea vegetal individual y operadores y por último, la identificación de “organismos indicadores”.

• El medio de cultivo puede contaminarse a causa de una insuficiente esterilización y/o durante la manipulación después del autoclaveo. Esto puede evitarse garantizando que cada ciclo de autoclaveo se lleve a cabo con la temperatura adecuada.

• Las levaduras y los hongos introducidos durante las manipulaciones del medio de cultivo generalmente crecen en forma de colonias visibles después de una o dos semanas de incubación a temperatura ambiente, y el medio puede haber sido descartado antes de introducir las plantas si se observaron aparentes colonias, sin embargo, los medios son generalmente utilizados antes de que este crecimiento se haga visible y/o son ubicados en locales fríos donde las tasas de crecimiento fungoso son limitadas.

• La detección de las bacterias introducidas durante la preparación del medio es más difícil de acuerdo a lo que se ha explicado en epígrafes anteriores, aunque, el medio puede ser testado por adición de nutrientes extras en forma de caldo nutriente o caldo triptona-soya después de ser vertido. Esto permite el crecimiento bacterial y la detección visible de colonias de microorganismos en el medio.

• La adición de reguladores del crecimiento sensitivos al calor mediante la esterilización del filtro después del autoclaveo, permiten que el medio sea autoclaveado por más tiempo. El éxito de la esterilización de los ciclos individuales de autoclaves puede ser monitoreado por la cinta para autoclave u otros indicadores físicos de temperatura o mediante métodos biológicos más precisos que son basados en la sobrevivencia de esporas de Bacillus.

Como se describió anteriormente para el subcultivo del material vegetal, la contaminación durante el servido manual del medio puede ser evitada mediante el entrenamiento de los operadores en técnicas asépticas, conjuntamente con la evaluación de los medios servidos en busca de la presencia de contaminantes. Los sistemas de dosificación de medios mecanizados y semimecanizados usualmente resultan en ninguna contaminación o en menor tasa de contaminantes que cuando esta operación se hace manualmente, pero costosos y necesitan mantenimiento periódico.

Existe poca información sobre el número y tipos de organismos que son introducidos durante el subcultivo del material de las cabinas de flujo laminar, pero las tasas en que los mismos aparecen están en dependencia de las técnicas de asepsia y del equipamiento usado, además, en esto influye también el operador y si las plantas fueron subcultivadas hacia el frente del flujo laminar.

Fuentes

• Folgueras, Maryluz. La contaminación microbiana en la micropropagación in vitro de las raíces y tubérculos tropicales/ Maryluz. Folgueras. -Tesis para aspirar al título de Master en Agricultura Sostenible (Mención Sanidad Vegetal), L. Herrera, Tutor. Santa Clara, Villa Clara. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, 2000, -71 h.

• Microorganismos contaminantes en la propagación masiva de colocasia esculenta y Xanthosoma spp. en la Biofábrica del MINAG en Villa Clara/ Maryluz, Folgueras…[et al.] Centro Agrícola (Santa Clara) 28, (3): 73-79, 2001.