EcuRed - Contribuciones del colaborador [es]

BIOIL-FC

2010-05-11T15:42:44Z

MiguelAngel cebimar:

{{Mejorar|faltan las fuentes}}'''BIOIL-FC: Tecnología de Biorremediación '''

El consumo de petróleo como fuente de energía ha conducido a un continuo aumento de la contaminación del entorno, especialmente del medio marino. En el mar, la biodegradación natural de los hidrocarburos del petróleo es un proceso muy lento y los daños alecosistema perduran por largos períodos de tiempo.

BIOIL-FC resultó una tecnología efectiva para mitigar los daños ecológicos y económicos ocasionados por estos derrames de hidrocarburos, garantizando una rápida y adecuada recuperación del área impactada a un bajo costo.

Los estudios de impacto ambiental de la aplicación del BIOIL-FC (no se presentan) realizados por POL-E-MAR INC (Canadá) y el aval del Centro de Información, Gestión y Educación Ambiental demuestran que esta tecnología no representa una contaminación secundaria para el medio ambiente, a diferencia de otros productos comerciales aplicados a nivel internacional.

Debido a la eficacia y bajos costos de producción de BIOIL-FC y que es la única tecnología nacional con que cuenta el país, esta incluido dentro del Plan Nacional de Contingencia contra Desastres por Derrames de Hidrocarburos del Estado Mayor Nacional de la Defensa Civil.

El diseño y construcción de un fermentador móvil constituye una innovación tecnológica en la producción de BIOIL-FC para nuestras condiciones, con el consiguiente ahorro de recursos.

Los resultados obtenidos nos han permitido poner a punto una novedosa tecnología, aplicable a cualquier tipo de derrame de hidrocarburos en latitudes tropicales, hecho sin precedentes en los países del área.

== Concepto de BIOIL-FC ==

Es un producto diseñado para combatir la contaminación de petróleo en ambiente marino, el cual, esta compuesto por un cultivo mixto de bacterias marinas (A-5) y enriquecido con B. alcalophilus IDO-225. Es no tóxico y biodegradable

=== Obtención ===

La obtención de las cantidades de BIOIL-FC necesarias para el tratamiento de derrames y el control de la calidad del bioproducto se realiza según la carta tecnológica propuesta por Núñez (2003). El proceso productivo se desarrolla en Plantas de Producción existentes en el país utilizando fermentadores de 800L y 25000L de volumen efectivo para las etapas de propagación y producción respectivamente. También se cuenta con una infraestructura para el trabajo biotecnológico en grupos multidisciplinarios que permite diseñar fermentadores con recursos existentes, para llevar a cabo trabajos de obtención del bioproducto a escala industrial.

=== Aplicación ===

El bioproducto se añadió luego de aplicarse técnicas de confinación y recuperación mecánica del petróleo, de forma parcial, aplicando cada templa de 10 000 ó 5000 L que se extraía según el caso. El producto fue asperjado a razón de 2L del bioproducto/m2 de área contaminada, teniendo en cuenta la componente horizontal de la corriente de marea. El bioproducto fue añadido desde la costa, en un camión cisterna con una bomba impulsora y desde una embarcación en el mar, aproximadamente a 150 metros de la costa. En el caso particular de la Ensenada de Arroyo Blanco no se aplicaron previamente técnicas de recuperación mecánica, por las características de la zona dañada.

== Evolución de los microorganismos degradadores ==

Los niveles de microorganismos antes y después del tratamiento con BIOIL-FC de los derrames ocurridos en la Bahía de Cienfuegos, Bahía de Matanzas, playa Arroyo Bermejo y ensenada de Arroyo Blanco, evidencian un incremento notable de los niveles de microorganismos degradadores de hidrocarburos en cada tratamiento para las estaciones evaluadas.

El análisis cualitativo de los hidrocarburos por cromatografía gaseosa demostró la presencia de compuestos petrógenicos contaminates y tóxicos antes del tratamiento con el BIOIL-FC, aún cuando en dos de los ecosistemas la contaminación persistía después de más de un mes de vertido. Los muestreos realizados una vez aplicado el BIOIL-FC evidenciaron una drástica disminución de las normales parafinas y la reducción del área de la mezcla de compuestos no resueltos (UCM), lo que evidencia la degradación en las fracciones aromáticas, resinas y asfaltenos, en las estaciones de cada uno de los tratamientos realizados.

Roberto Núñez*; Julio .Oramas *; Eudalys Ortiz*, Elsa Fonseca*; Osmar Barbán*;[[Category:Ingenierías_y_Tecnologías|Ingenierías_y_Tecnologías]]

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Biorremediación de hidrocarburos

2010-05-05T14:48:42Z

MiguelAngel cebimar:

'''Biorremediación de hidrocarburos '''

El ambiente marino posee una pobre capacidad de respuesta al impacto de los hidrocarburos petrolíferos, tanto por la baja concentración de nutrientes disponibles (nitrógeno y fósforo), como por la baja frecuencia de aparición de bacterias hidrocarbonoclastas. Teniendo en cuenta la posibilidad que ofrecen las células inmovilizadas de transformar los hidrocarburos del petróleo sin que ocurra duplicación celular.

== Características ==

Se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que no es necesario añadir nutrientes al agua de mar para que ocurra una degradación eficiente de los hidrocarburos del petróleo por parte del BIOIL y que la acción de este producto no se inhibe por altas concentraciones de hidrocarburos (hasta el 8 %).

BIOIL es efectivo frente a los hidrocarburos del petróleo en ausencia de fuentes de nitrógeno y fósforo lo cual lo hace más económico y menos tóxico al ambiente marino.Este producto mantiene su capacidad degradadora a altas concentraciones de hidrocarburos (hasta el 8 %) sin añadir nutrientes al medio de transformación.

== La biodegradación microbiana ==

La biodegradación microbiana del petróleo es un proceso complejo que consiste en transformarlo en otros compuestos más solubles e inestables. Esta se lleva a cabo por acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con incorporación directa de oxígeno molecular <ref>(Lee y Levy, 1989)</ref>.

Cada una de estas enzimas controla un paso de las vías metabólicas, por las cuales las sustancias tóxicas son transformadas en productos no tóxicos.<ref>(Wackett y Ellis, 1998)</ref>

La inoculación directa de microorganismos degradadores de petróleo, principalmente bacterias, ha sido estudiada como una vía para disminuir las consecuencias nocivas de un derrame. La velocidad de degradación de hidrocarburos es mayor por éste método y además se evitan los metabolitos tóxi-cos que se forman durante el proceso de biodegradación cuando se utilizan fertilizantes orgánicos <ref>(Lee y Tremblay, 1995)</ref>.

El uso de células inmovilizadas ofrece una alternativa con respecto a las aplicaciones convenciona-les llevadas a cabo con células libres. Por esta razón en el Instituto de Oceanología se obtuvo un producto de células inmovilizadas patentado y denominado BIOIL <ref>(Bellota et al., 1994)</ref>.

== BIOIL ==

Producto formado por el cultivo mixto A-5 inmovilizado en gel de pectina cítrica. Medio de degradación empleado: Medio Salino <ref>(Vela y Ralston, 1978)</ref>, suplementado con 3% de petróleo Romashkino (32 API).

Teniendo en cuenta la posibilidad que ofrecen las células inmovilizadas de transformar los hidrocar-buros del petróleo a través de un mecanismo de bioconversión hasta transformarlo en CO2 y H2O sin necesidad de una duplicación celular, es necesario realizar un estudio de la necesidad o no de añadir nutrientes al BIOIL.

El objetivo de éste trabajo fue analizar la necesidad de adicionar nitrógeno y fósforo al medio cuan-do se usa BIOIL en derrames masivos de hidrocarburos en el mar.

== Influencia de la concentración del petróleo en la degradación ==

Se inoculó 1g del producto en agua de mar con petróleo al 8% (v/v) y se realizó la extracción de hidrocarburos residuales a los 30 días. Todos los experimentos se realizaron con petróleo ligero Romashkino, la esterilización se realizó a 121 ºC durante 15 minutos y como control se utilizó medio estéril sin inocular.

El petróleo residual en todos los casos, fue recuperado mediante la extracción de hidrocarburos del medio utilizando CCl4 como solvente de extracción (tres extracciones sucesivas con 10 mL del sol-vente).

Los extractos de hidrocarburos totales se analizaron cualitativamente por cromatografía gaseosa, en un equipo PU 4400 con detector iónico de llama y columna capilar de sílice fundida de 40mx0.25dm recubierta con SE 54. El gradiente de temperatura programado fue de 50 270oC a 6oC.min-1.

== La biodegradación ==

La biodegradación es el proceso natural más importante para eliminar los hidrocarburos del petróleo presentes en el medio marino mediante la transformación de estos en oxígeno, dióxido de carbono y agua. Este proceso se lleva a cabo por microorganismos capaces de crecer y desarrollarse en el medio, usando dicha materia orgánica como sustrato y fuente de energía.<ref>Bergueiro y Domínguez, 1996)</ref>

La velocidad de degradación de las moléculas orgánicas por los microorganismos, bacterias en particular, depende de la configuración del sustrato, por lo cual, compuestos hidrocarbonados como el pristano y el fitano, son utilizados como trazadores biogeoquímicos en la identificación y curso de la biodegradación de crudos <ref>(Rontani et al, 1986)</ref>.

Por esta razón, la disminución en los perfiles cromatográficos de los picos correspondientes a estos compuestos permite asegurar que la degradación es debida a la acción microbiana y no a otras causas.

No se observan diferencias notables entre las diferentes variantes estudiadas por lo que podemos inferir que las células inmovilizadas no necesitan nutrientes para llevar a cabo la degradación del sustrato, aunque el medio se encuentre desbalanceado, utilizando éste por un meca-nismo de bioconversión.

La variante D resulta más atractiva ya que no es necesario fertilizar la mancha, disminuyendo los cos-tos de aplicación y evitando la contaminación del ambiente marino, no sólo por la presencia de estos compuestos químicos, sino también por los productos metabólicos que se forman durante el crecimien-to celular y que pueden ser más dañinos que el petróleo.

Una vez efectuada la recogida mecánica del crudo derramado, la biodegradación es el mecanismo más importante, efectivo y económico para la eliminación final de los hidrocarburos del petróleo presentes en el medio marino. Bajo su acción se ponen en juego múltiples reacciones de oxidación que conducen a la formación de hidrocarburos de menor peso molecular, además de la formación de dióxido de carbono, agua y biomasa microbiana.

Este proceso se lleva a cabo por microorganismos capaces de crecer y desarrollarse en el medio, usando dicha materia orgánica como sustrato y fuente de energía.

El petróleo Romashkino de 32 API está formado fundamentalmente por parafinas ligeras menores de C18, son degradadas fácilmente por los mecanismos de metil y oxidación, dando generalmente CO2 y H2O <ref>(Ramos et al, 1990)</ref>. Por eso, este tipo de petróleo es muy susceptible a la degradación microbiana.

El BIOIL, producto formado por un cultivo mixto, degrada todos los componentes del petróleo simul-táneamente y no de forma secuencial como cuando son atacados por un cultivo puro.

Unos microor-ganismos degradan las fracciones parafínicas y otros el resto de los componentes según la afinidad por el sustrato y en dependencia del gasto energético, lo cual trae consigo que cada uno realice el proceso de biotransformación a diferentes velocidades. Esto depende en gran medida de la compe-tencia por el sustrato y de la velocidad de degradación de cada microorganismo.

En la bibliografía, se refiere que la oxidación total de un sustrato de múltiples componentes como el petróleo requiere de la acción simultánea o sucesiva de varios microorganismos para lograr una mayor eficiencia en la degradación <ref>(Van der Linden, 1978; Rambeloarisoa et al., 1984).</ref>. 

Joseph, I.N. en 1996 demostró que el porcentaje de hidrocarburos eliminado con un cultivo mixto es un orden superior que con un cultivo puro.

En la proporción crudo - BIOIL (8:1), se evidencia que el producto, aún en ausencia de nutrientes no se inhibe por altas concentraciones de petróleo.

Omar et al. (1990) demostraron que con estas mismas concentraciones de crudo (8%) Candida parapsilosis inmovilizada degrada el 90% en sólo 3 semanas mientras que con células libres en el mismo período se degradó sólo un 27,5%

Todos los productos descritos en la bibliografía consultada emplean nutrientes para potenciar el proceso de degradación. Entre ellos tenemos el BIOTEMPOSCREEM, producto ruso liofilizado que contiene en su composición 14 especies de microorganismos hidrocarbonoclastas, nutrientes y un catalizador biológico biodegradable.

(Kaushansky, 1994), el PUTIDOIL, producto ruso liofilizado, formado por una cepa de Pseudomonas putida y nutrientes <ref>(Bergueiro y cols., 1994, patente norteamericana No. 4.822.490)</ref> y un producto japonés que contiene nutrientes y microorganismos hidrocarbonoclastas inmovilizados en alginato de calcio <ref>(Bergueiro y cols., 1994, patente norteamericana No. 4.822.490)</ref>.

== Bibliografía ==

*Bellota, M.R. et al. (1994) ”Bioproducto para combatir la contaminación por hidrocarburos del petróleo y sus derivados” Certificado de autor de invención, País: Cuba No 22 323.
*Bergueiro, J. R. et al. (1994). Bioproducto del crudo de petróleo Brent procedente del siniestro del "Ae-gean sea". III Congreso de Ciencias del Mar. Resúmenes: 193.
*Bergueiro, J. R. y Domínguez, F., (1996): “Evaporación y mezclas de hidrocarburos”. Editorial Bilbilis. 348 p p.
*Hideki, O. (1994). A new carrier for oil degrading bacteria. Programa and abstracts fourth international marine biotechnololgy conference, Tromso, Nonvay.
*Joseph, I.N. (1996): “Microorganismos marinos degradadores de Hcs y sus aplicaciones en la industria petrolera”. Tesis para optar por el título de “Maestro en Ciencias Biológicas. 56 pp.
*Kaushansky (1994). Comunicación personal.
*Lee, K. and Levy, E.M. (1989): “Biodegradation of petroleum in the marine enviroment and its en-hancement”. Offprints from aquatic Toxicology and water quality management. Edited by Jerome A. Nriagy 217-243p
*Lee, K. and Tremblay, G. H., (1995): “Biorremediation of oiled beach sediments. Assessment of inor-ganic and organic fertilizers, evolving technologics” Oil spill Conference: 107-112 p.
*Omar, S.H.et al (1990): “Degradation of oily sludge from a flotation unit by free and inmovilized micro-organism”. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34(2): 259-263p.
*Rambeloarisoa, E et al (1984): “Degradation of crude oil by mixed culture of bacteria isolated from foams“ Mar. Biol., 83: 69- 81p.
*Ramos, I et al., (1990): Bioconversión de hidrocarburos petrolíferos presentes en agua de capa en ensa-yos pilotos”. Quimioindustria 90. Memorias, 32p.
*Rontani, J.F. et al. (1986): “Gas chromatographic and gas chromatography/ mass spectrometry applied to the determination of to new pathway of pristane degradation by to marine mixed bacterial popula-tion”. Mar.Chem., 18: 9-16p.
*Van der Linden, A. C. (1978) “Degradation of oil in the marine environment. In J. R. Watkinson (Ed), Developments in Biodegration of Hydrocarbons”, Elsevier Applied Science. 1: 165-200p.
*Vela, G.R. and Ralston, (1978): “The effect of temperature on phenol degradation in waste water” Can. J. Microb. 24(11): 366-370p.
*Wackett, L. P. and Ellis, L., (1998). “Bioremediation”. Microsoft. Encarta. Encyclopedia. Microsoft Corporation. All rights reserved.

== Referencias ==

<references />

== Enlace externo ==

*[http://www.medioambiente.cu Centro de Bioproductos Marinos]

[[Category:Biotecnología]] [[Category:Control_de_la_contaminación_del_agua]] [[Category:Bacteriología]]

Bacterias del género Bacillus

2010-05-05T14:41:12Z

MiguelAngel cebimar:

'''Bacterias del género Bacillus '''

La contaminación del ambiente marino por hidrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El bioproducto BIOIL-FC, diseñado para combatir los derrames de petróleo, está formado por bacterias degradadoras de hidrocarburos, tales como Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60. El presente trabajo está dirigido a determinar y comparar los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60 en n-hexadecano mediante el conteo en cámara de Neubauer y el método de Lineweaver-Burk, así como definir los nuevos modelos de inhibición del crecimiento.

El  Bacillus licheniformis cepa CBM-60 degrada el n-hexadecano a mayor velocidad que el Bacillus alcalophilus cepa CBM-225, no reflejando inhibición de su crecimiento en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, la composición bacteriana del bioproducto BIOIL-FC puede ser enriquecida con una mayor proporción de la cepa CBM-60 para combatir derrames de petróleo con altas concentraciones en n-hexadecano. 

== La contaminación ambiental por hidrocarburo ==

La contaminación ambiental por hidrocarburos del petróleo y en particular del ambiente marino, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El océano constituye un ecosistema muy dinámico y complejo, que el hombre está destruyendo con contaminantes químicos, entre ellos el petróleo y sus derivados, llegando a comprometer la trama alimentaria del medio marino. La posición geográfica de nuestro archipiélago y el tráfico marítimo en torno al mismo, así como la creciente explotación y perforación de pozos de petróleo en nuestra plataforma, aumentan considerablemente la posible contaminación de las costas.

Desde finales de la década del 80 del siglo pasado, el departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos ([[CEBIMAR]]) perteneciente al [[Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente|Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente]], ha trabajado en el aislamiento y conservación de bacterias aisladas de ecosistemas marinos capaces de degradar petróleo <ref>Joseph, N.; Capó, M. C.; Bellota, M.; Ramos, Y.; Fuentes, M. (1994): Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana. Revista Ciencias Biológicas. Microbiología. 27:137-148..</ref>, las cuales forman parte de la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del centro en la actualidad A partir de una selección de estas cepas se formuló el bioproducto BIOIL-FC. La efectividad de este bioproducto se ha comprobado durante los tratamientos de derrames de petróleo ocurridos en las Bahía de Cienfuegos y de Matanzas, en el recalo accidental de petróleo que contaminó la Playa Arroyo Bermejo en Jibacoa y en la Ensenada de Arroyo Blanco en Holguín <ref>Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.</ref>con resultados satisfactorios. 

== Bioil- Fc ==

El BIOIL-FC está formado por cinco bacterias degradadoras de hidrocarburos, Dentro de éstas se encuentran Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 como las más importantes y las escogidas para desarrollar el siguiente estudio.

== Microorganismos empleados ==

El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 <ref>Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.</ref>aislados de los sedimentos de la Bahía de Cárdenas, Matanzas y pertenecientes a la CBM del CEBIMAR. 

== Medios de cultivo ==

Para la conservación de las cepas CBM-225 y cepa CBM-60 se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según <ref>Gorbienko (1961)</ref>, la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana de la cepa CBM-225 se realizó según <ref>Gorvienko, Y. A. (1961): Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos. Mikrobiol. 30(1) 168-172.</ref> y para la cepa CBM-60 se llevó a cabo según <ref>Ortiz, E. (2004): Obtención de un tensioactivo a partir de una bacteria marina para la biorremediación de la contaminación con hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp:15-62.</ref>. Los estudios cinéticos del crecimiento se desarrollaron en el medio de degradación de hidrocarburos propuesto por <ref>Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.</ref>, estos medios contenían concentraciones de n-hexadecano (Merck-Schuchardt, 99 % de pureza) de 5, 10, 20, 30, 40 y 60 g. L-1, 

== Condiciones de cultivo en zaranda ==

Todos los experimentos desarrollados a escala de zaranda fueron realizados a partir de cultivos de 24 horas en cuñas de medio # 6 agarizado <ref>Gorvienko, Y. A. (1961): Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos. Mikrobiol. 30(1) 168-172.</ref>. Con este cultivo se obtuvo el preinóculo en el medio de obtención de biomasa <ref>Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.</ref>. Luego de 24 horas, el cultivo fue inoculado a una concentración inicial de 106 celmL-1 en los medios de degradación <ref>Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.</ref>, de los cuales fueron tomadas muestras cada cuatro horas. Todos los experimentos fueron desarrollados a escala de zaranda orbital rotatoria Infors a 125 r.min-1 y 30 ºC. Los medios de cultivo fueron esterilizados a 121 oC por 15 minutos y fue utilizado como control un medio de cultivo estéril en las mismas condiciones. 

== Crecimiento microbiano en medio de degradación de hidrocarburos ==

La determinación del crecimiento microbiano en el medio de degradación de hidrocarburos se realizó mediante el conteo total de células en cámara de Neubauer <ref>Martínez, J.; Sánchez, A. I.; Quintana, M.; Pazos, V.; Del Barrio, G. (1989): “Microbiología General”. Editorial Pueblo y Educación. 3: 31-101.</ref>. Velocidad específica de crecimiento (µ) La µ fue determinada en la fase exponencial del crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido <ref>López, J.; Gódia C. F. (1998): Ingeniería Bioquímica. 1ra Edición. Ed. SINTESIS, S.A. pp: 9-45.</ref>. Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60

Para cada una de las concentraciones de sustrato fue calculada en la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60. A partir de ellas fueron estimados los valores de velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y de la constante de disociación o constante de afinidad (Ks) mediante la transformación lineal de Lineweaver-Burk <ref>Chavez, P. M.; Díaz, D. J.; Pérez, L. V.; Delfín, G. J. (1990):Temas de Enzimología. Tomo I. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:51-87..</ref>. Además, fue determinada la constante de inhibición (Ki) de ambas cepas con n-hexadecano según la expresión de Andrews linealizada <ref>Boyer, R. (1999): Concepts in Biochemistry. Ed: Keith Dodson. Chapter 4. Amino acids, peptides, and proteins. pp78-110, Chapter 6. Enzymes as biological catalysts. 142-170pp and Chapter 15. Metabolism of carbohydrates. pp:445-483. Copyright © by Brooks/Cole Publishing Company. USA.</ref>. Determinación del modelo cinético de las cepas CBM-225 y CBM-6.

La determinación de los nuevos modelos cinéticos y los valores de Ki en la zona de inhibición del crecimiento de ambas cepas se realizó mediante la ecuación modificada de Andrews según <ref>Cabranes Y. C. (2005). Cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo por Bacillus alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de maestría. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:28-49.</ref>.

== Referencias ==

<references />

== Enlace externo ==

*[http://www.medioambiente.cu Centro de Bioproductos Marinos  ]       

 

[[Category:Biología_molecular]] [[Category:Microbiología]] [[Category:Ciencias_Médicas_y_Biológicas]]

BIOIL-FC

2010-05-05T14:38:14Z

MiguelAngel cebimar:

{{Mejorar|faltan las fuentes}}'''BIOIL-FC: Tecnología de Biorremediación '''

El consumo de petróleo como fuente de energía ha conducido a un continuo aumento de la contaminación del entorno, especialmente del medio marino. En el mar, la biodegradación natural de los hidrocarburos del petróleo es un proceso muy lento y los daños alecosistema perduran por largos períodos de tiempo.

BIOIL-FC resultó una tecnología efectiva para mitigar los daños ecológicos y económicos ocasionados por estos derrames de hidrocarburos, garantizando una rápida y adecuada recuperación del área impactada a un bajo costo.

Los estudios de impacto ambiental de la aplicación del BIOIL-FC (no se presentan) realizados por POL-E-MAR INC (Canadá) y el aval del Centro de Información, Gestión y Educación Ambiental demuestran que esta tecnología no representa una contaminación secundaria para el medio ambiente, a diferencia de otros productos comerciales aplicados a nivel internacional.

Debido a la eficacia y bajos costos de producción de BIOIL-FC y que es la única tecnología nacional con que cuenta el país, esta incluido dentro del Plan Nacional de Contingencia contra Desastres por Derrames de Hidrocarburos del Estado Mayor Nacional de la Defensa Civil.

El diseño y construcción de un fermentador móvil constituye una innovación tecnológica en la producción de BIOIL-FC para nuestras condiciones, con el consiguiente ahorro de recursos.

Los resultados obtenidos nos han permitido poner a punto una novedosa tecnología, aplicable a cualquier tipo de derrame de hidrocarburos en latitudes tropicales, hecho sin precedentes en los países del área.

== Concepto de BIOIL-FC ==

Es un producto diseñado para combatir la contaminación de petróleo en ambiente marino, el cual, esta compuesto por un cultivo mixto de bacterias marinas (A-5) y enriquecido con B. alcalophilus IDO-225. Es no tóxico y biodegradable

=== Obtención ===

La obtención de las cantidades de BIOIL-FC necesarias para el tratamiento de derrames y el control de la calidad del bioproducto se realiza según la carta tecnológica propuesta por Núñez (2003). El proceso productivo se desarrolla en Plantas de Producción existentes en el país utilizando fermentadores de 800L y 25000L de volumen efectivo para las etapas de propagación y producción respectivamente. También se cuenta con una infraestructura para el trabajo biotecnológico en grupos multidisciplinarios que permite diseñar fermentadores con recursos existentes, para llevar a cabo trabajos de obtención del bioproducto a escala industrial.

=== Aplicación ===

El bioproducto se añadió luego de aplicarse técnicas de confinación y recuperación mecánica del petróleo, de forma parcial, aplicando cada templa de 10 000 ó 5000 L que se extraía según el caso. El producto fue asperjado a razón de 2L del bioproducto/m2 de área contaminada, teniendo en cuenta la componente horizontal de la corriente de marea. El bioproducto fue añadido desde la costa, en un camión cisterna con una bomba impulsora y desde una embarcación en el mar, aproximadamente a 150 metros de la costa. En el caso particular de la Ensenada de Arroyo Blanco no se aplicaron previamente técnicas de recuperación mecánica, por las características de la zona dañada.

== Evolución de los microorganismos degradadores ==

Los niveles de microorganismos antes y después del tratamiento con BIOIL-FC de los derrames ocurridos en la Bahía de Cienfuegos, Bahía de Matanzas, playa Arroyo Bermejo y ensenada de Arroyo Blanco, evidencian un incremento notable de los niveles de microorganismos degradadores de hidrocarburos en cada tratamiento para las estaciones evaluadas.

El análisis cualitativo de los hidrocarburos por cromatografía gaseosa demostró la presencia de compuestos petrógenicos contaminates y tóxicos antes del tratamiento con el BIOIL-FC, aún cuando en dos de los ecosistemas la contaminación persistía después de más de un mes de vertido. Los muestreos realizados una vez aplicado el BIOIL-FC evidenciaron una drástica disminución de las normales parafinas y la reducción del área de la mezcla de compuestos no resueltos (UCM), lo que evidencia la degradación en las fracciones aromáticas, resinas y asfaltenos, en las estaciones de cada uno de los tratamientos realizados.

[[Category:Ingenierías_y_Tecnologías]] [[Category:Medio_Ambiente]] [[Category:Ciencias_Médicas_y_Biológicas]] [[Category:Ciencias_Biológicas]]

Cinética de degradación del naftaleno

2010-05-03T14:38:30Z

MiguelAngel cebimar:

'''Cinética de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de bacillus alcalophilus cepa IDO-225 strain'''

Numerosas han sido las investigaciones sobre el estudio de la biorremediación para su aplicación en la lucha para combatir la contaminación ambiental por hidrocarburos. El Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Ambiente, ha trabajado de 1988 en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar el petróleo. En la actualidad, cuenta con cuatro bioproductos degradadores de petróleo en medio marino denominados BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC e IDO-225. En el presente trabajo, se demuestra por Espectroscopía Infrarroja de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de contacto de las células húmedas inmovilizadas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 en el medio de degradación con el naftaleno, un hidrocarburo del petróleo, que estás son capaces de degradar el naflateno como única fuente de carbono y energía.  Las células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 son capaces de utilizar el naftaleno como única fuente de carbono y energía. El mecanismo propuesto para oxidación del naftaleno se basa en la metil-oxidación y en la -oxidación. 

== '''La biorremediación''' ==

 La biorremediación es la adición de materiales a medio ambientes contaminados para acelerar los procesos de biodegradación natural.1 Es conocida como el principal proceso natural para eliminar del medio ambiente las fracciones no volátiles del petróleo, por lo que permite reducir notablemente las concentraciones de petróleo residual. 2 Esto contribuye de modo muy efectivo a que se garantice una rápida y adecuada recuperación del área impactada por el derrame.3 La biodegradación microbiana es un proceso lento, que está determinado por numerosos factores como la concentración y estructura química de las sustancias a degradar, tipo y concentración de microorganismo y factores físicos y químicos.4,5 Las condiciones ambientales desfavorables influyen en el desarrollo de los microorganismos degradadores. Entre estas condiciones ambientales están: las bajas temperaturas existentes en el mar, la alta salinidad, la cual influye en la permeabilidad de la membrana celular, las bajas concentraciones de nutrientes, específicamente nitrógeno y fósforo, así como bajas concentraciones de oxígeno disuelto. 6 Las características moleculares del hidrocarburo son un factor importante a tener en cuenta, ya que determinan la solubilidad del hidrocarburo en agua y definen la velocidad y los mecanismos de ataque del microorganismo. El número de átomos de carbono, las ramificaciones, los anillos (aromáticos o no, su número y ubicación) y la presencia de sustituyentes, confieren ciertas particularidades a algunas etapas del proceso de biotransformación para determinados hidrocarburos. 7 En el caso de los hidrocarburos aromáticos, que comprende al benceno (C6H6) y sus homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es saturada. Al producirse la oxidación del anillo, éste se abre por un doble enlace y se obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes productos intermedios. 8 El Instituto de Oceanología trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas degradadoras de petróleo y cuenta con un bioproducto llamado BIOIL formado por cepas del género Bacillus, capaces de llevar a cabo la degradación de hidrocarburos con gran eficiencia y tiene la ventaja de no incluir nutrientes en su formulación. 9 De las cepas integrantes de este bioproducto, se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que la cepa IDO-225 es la responsable del alto porcentaje de actividad, razón por la cual fue la escogida para el desarrollo de este estudio.

== '''Materiales y métodos''' ==

 '''Microorganismo empleado''' El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa IDO-225, aislada de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas11 perteneciente a la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del Instituto de Oceanología. '''Medios de Cultivo''' Para la conservación del Bacillus alcalophilus se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según Gorbienko12 y la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana se realizó según Núñez.13 En la degradación de naftaleno por las células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se empleó un medio que contenía naftaleno (30 g/L) disueltos en 1L de agua de mar. 9, 13 '''Obtención del bioproducto inmovilizado ''' Para obtener la biomasa, el cultivo se sedimentó a 700 xg en una centrífuga refrigerada Berkman (USA). Las células fueron inmovilizadas por atrapamiento en gel según la metodología descrita por Bellota. 9 Evaluación de la capacidad degradadora de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Se realizó un experimento por bloques completamente aleatorizado, con las células de IDO-225 inmovilizadas húmedas en el medio de degradación. La capacidad degradadora se determinó inoculando 0.5 g de cada bioproducto en frascos Erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 50 mL de medio de degradación. Como control se utilizó medio de cultivo estéril. Los experimentos se realizaron en zaranda orbital rotatoria Infors (Suiza) a125 r/min y 30 ºC durante15 días. Se tomaron muestras cada 3 días para la determinación de la concentración de hidrocarburos según Dubois.14 '''Estudio del posible mecanismo de degradación''' El hidrocarburo residual y el resto de los componentes orgánicos del proceso fermentativo fueron recuperados cada 3 días mediante tres extracciones sucesivas con 50 mL del solvente (CCL4) (1:1) (v/v) en la fase orgánica, las cuales fueron posteriormente deshidratadas con Na2SO4. El análisis cualitativo y cuantitativo de los hidrocarburos de la fase orgánica se realizó por espectroscopía infrarrojo en un Konik de fabricación norteamericana. '''Tratamiento estadístico de los resultados''' Para el procesamiento estadístico de los resultados se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple 15 y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan. 16 Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1. 

Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1 

 

 Figura 1. Consumo de naftaleno por las células inmovilizadas húmedas de B. alcalophilus en medio de degradación. 

 

La curva de concentración de naftaleno (Fig. 1) muestra la transformación de este sustrato por el microorganismo inmovilizado. Los niveles de este hidrocarburo disminuyeron rápidamente en los primeros 6 días, posteriormente continúan disminuyendo lentamente alcanzando un alto porcentaje de remoción al final del proceso. Tabla 1. Modelos cinéticos de degradación de naftaleno por células libres e inmovilizadas de Bacillus alcalophilus donde C representa la concentración de naftaleno en g/L.

Modelo cinético de degradación R2 Células libres dC/dt = -0.0693C2+0.5366C-0.8 0.9620 Células inmovilizadas dC/dt = -0.0580C2-0.2667C+0.3 0.9770

El modelo cinético de segundo orden obtenido durante el proceso de biodegradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 (Tabla 1), según Head17 y Núñez18, se corresponde con un mecanismo de metil-oxidación representado por el coeficiente del término cuadrático y una -oxidación por el coeficiente del término de primer orden. Según los resultados, el modelo cinético y la velocidad a la que ocurrió el proceso, es poco probable que ocurran mecanismos de -oxidación y -oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos.17 El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación. Al comparar los modelos cinéticos de segundo orden de la degradación de naftaleno por células inmovilizadas húmedas y células libres19 de Bacillus alcalophilus (Tabla 1), es necesario mencionar que en el caso de las células inmovilizadas pueden obtener energía suficiente y fácilmente para el mantenimiento celular a través de la metil-oxidación, por esta razón en el modelo cinético de esta variante el término cuadrático es mayor. Sin embargo en las células libres19 se observó que el coeficiente correspondiente a la -oxidación es mayor que en las células inmovilizadas, porque se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación acompañado de un gran requerimiento energético.17 Mediante el mecanismo de -oxidación de naftaleno por células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se obtiene acetil-CoA, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.20 El paso determinante en la velocidad de degradación del naftaleno es la metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo (Tabla 1) es mayor en las células inmovilizadas con respecto a las células libres19, por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus es mayor en el caso de las células inmovilizadas húmedas. Esto se debe a que las células libres, necesitan no sólo de fuente de carbono, sino de otros nutrientes para poder llevar a cabo sus procesos metabólicos. Sin embargo cuando están inmovilizadas, se encuentran en un estado de no crecimiento, ya que el medio se encuentra desbalanceado, ocurriendo la transformación del sustrato por un mecanismo de bioconversión donde la célula transforma el sustrato y además, obtiene la energía de mantenimiento a partir de la fuente de carbono.10 Resultados similares fueron obtenidos por Omar21 en 1990 cuando lograron un 30 % de degradación de crudo con Candida parapsilosis inmovilizada en arcilla en 4 semanas y sin embargo con células libres necesitaron 8 semanas para alcanzar igual nivel de degradación. 

 

== '''Bibliografía''' ==

 1. Chhatre S., Purohit H., Shanker R., Khanna P. Bacterial consortia for crude oil spill remediation, 18. Biennial Conference of the IAWQ, (Singapore), 23-28 Jun 1996. 2. Prince R.C. Petroleum spill bioremediation in marine environments, Crit. Rev. Microbiol. 19: 217-242, 1993. 3. Kirby M. F. y Matthiessen, R. J. Procedures for the approval of oil spill treatment products, Fish.-Res.-Tech.-Rep.-Dir.-Fish.-Res.-G.B. Lowestoft,-UK Ministry-of-Agricultur,-Fisheries-and-Food 1996, 102:19, 1996. 4. Bergueiro J.R. y Dominguez F. Dispersantes químicos y mareas negras, 195pp., 1992. 5. Al-Gounaim M.Y.y Diab A. Ecological Distribution and Biodegradational Activities of Oil-Degrading Marine Bacteria in the Arabian Gulf Water at Kuwait, Arab-Gulf-J-Sci-Res vol. 16 (2):359-377, 1998 6. Solanás, A.M. Biodegradación microbiana en la contaminación por hidrocarburos. Mundo Científico 1 (8): 913-920, 1985. 7. Bouchez M., Blanchet D.y Vandecasteele J. P. Substrate availability phenantrene biodegradation: transfer mechanism and influence on metabolism, Appl. Microb. Biotechnol., Oct. 43(5):952-960, 1995. 8. Sirvins, A. y Tramier, B. Biodegradation of hydrocarbons. Recherche 16 (171), 1985. 9. Bellota M., Fonseca E.L., Núñez R.R., Martínez J., Villaverde M. J., Joseph N.y Fuentes M. Bioproducto para combatir la contaminación por hidrocarburos de petróleo y sus derivados, Certificado #22323, C12N, 11/02 : CO2F 3/34, 1994. 10. Núñez, R. R.; Oramas, J; Fonseca, E.L.; López, J.S.; Ortiz, E.; Barbán, O.; Cabranes, Y y Martínez, C. Informe del proyecto ejecutivo de CESIGMA SA. Aplicación de la Biorremediación para mitigar los efectos de un derrame de petróleo en la Playa Jibacoa, 2001. 11. Joseph, N.; Capó, M.C.; Bellota, M.; Ramos, Y. y Fuentes, M. Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana. Ciencias Biológicas. Microbiología. 27:137-148, 1994. 12. Gorbienko Y. A. Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos, Mikrobiol, 30(1):168-172, 1961. 13. Núñez R. Obtención del bioproducto IDO-225 para combatir derrames de petróleo en el mar, Tesis para optar por el Título de Maestro en Ciencias. Universidad de La Habana, 1998. 14. Dubois, M., Gilles, K. A.., Hamilton, J. K.., Rebers, P. A. y Smith, F. Colorimetric method of determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350, 1956. 15. Lerch G. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas, Editorial Científico Técnica. La Habana. Capítulo 16: Análisis de Varianza. Clasificación triple: 251-277, 1977. 16. Duncan D. R. Multiple range multiple F-Test biometrics, 11:1-42, 1965. 17. Head I. Bioremediation: toward a credible technology, Microbiology, 144: 599-608, 1998. 18. Núñez, R.R. Biorremediación de derrame de hidrocarburos en ecosistemas marinos. Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano. Tesis de Doctorado, 2002. 19. Núñez, R.R.; Cabranes, Y.; Ortiz, E.; Gondres, R.; Martínez, C.y Martínez, J. Cinética de degradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus cepa IDO-225. Avicennia (en prensa), 2002. 20. Lehninger .A. Bioquímica. Ed. Revolucionaria. Cap.18, 19 y 20. 487-570pp., 1986. 21. Omar S.H.; Buedecker U. y Rehm H.J. Degradation of oily sludge from a flotation unit by free and inmovilized microorganism,. Appl. Microbiol. Biotechnol, 34(2):259-263, 1990.

Núñez,R.R.*; Cabranes, Y.*; Ortiz, E.*; Gondres, R.**; Martínez, C.*; Martínez, J.

Centro de Bioproductos Marinos        http//www.medioambiente.cu

 

 

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Cinética de degradación del naftaleno

2010-05-03T14:35:18Z

MiguelAngel cebimar: Página creada con ' '''Cinética de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de bacillus alcalophilus cepa IDO-225 strain''' Numerosas han sido las investigaciones so…'

'''Cinética de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de bacillus alcalophilus cepa IDO-225 strain'''

Numerosas han sido las investigaciones sobre el estudio de la biorremediación para su aplicación en la lucha para combatir la contaminación ambiental por hidrocarburos. El Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Ambiente, ha trabajado de 1988 en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar el petróleo. En la actualidad, cuenta con cuatro bioproductos degradadores de petróleo en medio marino denominados BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC e IDO-225. En el presente trabajo, se demuestra por Espectroscopía Infrarroja de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 días de contacto de las células húmedas inmovilizadas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 en el medio de degradación con el naftaleno, un hidrocarburo del petróleo, que estás son capaces de degradar el naflateno como única fuente de carbono y energía.  Las células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 son capaces de utilizar el naftaleno como única fuente de carbono y energía. El mecanismo propuesto para oxidación del naftaleno se basa en la metil-oxidación y en la -oxidación. 

== '''La biorremediación''' ==

 La biorremediación es la adición de materiales a medio ambientes contaminados para acelerar los procesos de biodegradación natural.1 Es conocida como el principal proceso natural para eliminar del medio ambiente las fracciones no volátiles del petróleo, por lo que permite reducir notablemente las concentraciones de petróleo residual. 2 Esto contribuye de modo muy efectivo a que se garantice una rápida y adecuada recuperación del área impactada por el derrame.3 La biodegradación microbiana es un proceso lento, que está determinado por numerosos factores como la concentración y estructura química de las sustancias a degradar, tipo y concentración de microorganismo y factores físicos y químicos.4,5 Las condiciones ambientales desfavorables influyen en el desarrollo de los microorganismos degradadores. Entre estas condiciones ambientales están: las bajas temperaturas existentes en el mar, la alta salinidad, la cual influye en la permeabilidad de la membrana celular, las bajas concentraciones de nutrientes, específicamente nitrógeno y fósforo, así como bajas concentraciones de oxígeno disuelto. 6 Las características moleculares del hidrocarburo son un factor importante a tener en cuenta, ya que determinan la solubilidad del hidrocarburo en agua y definen la velocidad y los mecanismos de ataque del microorganismo. El número de átomos de carbono, las ramificaciones, los anillos (aromáticos o no, su número y ubicación) y la presencia de sustituyentes, confieren ciertas particularidades a algunas etapas del proceso de biotransformación para determinados hidrocarburos. 7 En el caso de los hidrocarburos aromáticos, que comprende al benceno (C6H6) y sus homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es saturada. Al producirse la oxidación del anillo, éste se abre por un doble enlace y se obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes productos intermedios. 8 El Instituto de Oceanología trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas degradadoras de petróleo y cuenta con un bioproducto llamado BIOIL formado por cepas del género Bacillus, capaces de llevar a cabo la degradación de hidrocarburos con gran eficiencia y tiene la ventaja de no incluir nutrientes en su formulación. 9 De las cepas integrantes de este bioproducto, se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que la cepa IDO-225 es la responsable del alto porcentaje de actividad, razón por la cual fue la escogida para el desarrollo de este estudio.

== '''Materiales y métodos''' ==

 '''Microorganismo empleado''' El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa IDO-225, aislada de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas11 perteneciente a la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del Instituto de Oceanología. '''Medios de Cultivo''' Para la conservación del Bacillus alcalophilus se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según Gorbienko12 y la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana se realizó según Núñez.13 En la degradación de naftaleno por las células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se empleó un medio que contenía naftaleno (30 g/L) disueltos en 1L de agua de mar. 9, 13 '''Obtención del bioproducto inmovilizado ''' Para obtener la biomasa, el cultivo se sedimentó a 700 xg en una centrífuga refrigerada Berkman (USA). Las células fueron inmovilizadas por atrapamiento en gel según la metodología descrita por Bellota. 9 Evaluación de la capacidad degradadora de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Se realizó un experimento por bloques completamente aleatorizado, con las células de IDO-225 inmovilizadas húmedas en el medio de degradación. La capacidad degradadora se determinó inoculando 0.5 g de cada bioproducto en frascos Erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 50 mL de medio de degradación. Como control se utilizó medio de cultivo estéril. Los experimentos se realizaron en zaranda orbital rotatoria Infors (Suiza) a125 r/min y 30 ºC durante15 días. Se tomaron muestras cada 3 días para la determinación de la concentración de hidrocarburos según Dubois.14 '''Estudio del posible mecanismo de degradación''' El hidrocarburo residual y el resto de los componentes orgánicos del proceso fermentativo fueron recuperados cada 3 días mediante tres extracciones sucesivas con 50 mL del solvente (CCL4) (1:1) (v/v) en la fase orgánica, las cuales fueron posteriormente deshidratadas con Na2SO4. El análisis cualitativo y cuantitativo de los hidrocarburos de la fase orgánica se realizó por espectroscopía infrarrojo en un Konik de fabricación norteamericana. '''Tratamiento estadístico de los resultados''' Para el procesamiento estadístico de los resultados se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple 15 y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan. 16 Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1. 

Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento. 10 Los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación se presentan en la figura 1 

 

 Figura 1. Consumo de naftaleno por las células inmovilizadas húmedas de B. alcalophilus en medio de degradación. 

 

La curva de concentración de naftaleno (Fig. 1) muestra la transformación de este sustrato por el microorganismo inmovilizado. Los niveles de este hidrocarburo disminuyeron rápidamente en los primeros 6 días, posteriormente continúan disminuyendo lentamente alcanzando un alto porcentaje de remoción al final del proceso. Tabla 1. Modelos cinéticos de degradación de naftaleno por células libres e inmovilizadas de Bacillus alcalophilus donde C representa la concentración de naftaleno en g/L.

Modelo cinético de degradación R2 Células libres dC/dt = -0.0693C2+0.5366C-0.8 0.9620 Células inmovilizadas dC/dt = -0.0580C2-0.2667C+0.3 0.9770

El modelo cinético de segundo orden obtenido durante el proceso de biodegradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 (Tabla 1), según Head17 y Núñez18, se corresponde con un mecanismo de metil-oxidación representado por el coeficiente del término cuadrático y una -oxidación por el coeficiente del término de primer orden. Según los resultados, el modelo cinético y la velocidad a la que ocurrió el proceso, es poco probable que ocurran mecanismos de -oxidación y -oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos.17 El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación. Al comparar los modelos cinéticos de segundo orden de la degradación de naftaleno por células inmovilizadas húmedas y células libres19 de Bacillus alcalophilus (Tabla 1), es necesario mencionar que en el caso de las células inmovilizadas pueden obtener energía suficiente y fácilmente para el mantenimiento celular a través de la metil-oxidación, por esta razón en el modelo cinético de esta variante el término cuadrático es mayor. Sin embargo en las células libres19 se observó que el coeficiente correspondiente a la -oxidación es mayor que en las células inmovilizadas, porque se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación acompañado de un gran requerimiento energético.17 Mediante el mecanismo de -oxidación de naftaleno por células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se obtiene acetil-CoA, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.20 El paso determinante en la velocidad de degradación del naftaleno es la metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo (Tabla 1) es mayor en las células inmovilizadas con respecto a las células libres19, por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus es mayor en el caso de las células inmovilizadas húmedas. Esto se debe a que las células libres, necesitan no sólo de fuente de carbono, sino de otros nutrientes para poder llevar a cabo sus procesos metabólicos. Sin embargo cuando están inmovilizadas, se encuentran en un estado de no crecimiento, ya que el medio se encuentra desbalanceado, ocurriendo la transformación del sustrato por un mecanismo de bioconversión donde la célula transforma el sustrato y además, obtiene la energía de mantenimiento a partir de la fuente de carbono.10 Resultados similares fueron obtenidos por Omar21 en 1990 cuando lograron un 30 % de degradación de crudo con Candida parapsilosis inmovilizada en arcilla en 4 semanas y sin embargo con células libres necesitaron 8 semanas para alcanzar igual nivel de degradación. 

 

== '''Bibliografía''' ==

 1. Chhatre S., Purohit H., Shanker R., Khanna P. Bacterial consortia for crude oil spill remediation, 18. Biennial Conference of the IAWQ, (Singapore), 23-28 Jun 1996. 2. Prince R.C. Petroleum spill bioremediation in marine environments, Crit. Rev. Microbiol. 19: 217-242, 1993. 3. Kirby M. F. y Matthiessen, R. J. Procedures for the approval of oil spill treatment products, Fish.-Res.-Tech.-Rep.-Dir.-Fish.-Res.-G.B. Lowestoft,-UK Ministry-of-Agricultur,-Fisheries-and-Food 1996, 102:19, 1996. 4. Bergueiro J.R. y Dominguez F. Dispersantes químicos y mareas negras, 195pp., 1992. 5. Al-Gounaim M.Y.y Diab A. Ecological Distribution and Biodegradational Activities of Oil-Degrading Marine Bacteria in the Arabian Gulf Water at Kuwait, Arab-Gulf-J-Sci-Res vol. 16 (2):359-377, 1998 6. Solanás, A.M. Biodegradación microbiana en la contaminación por hidrocarburos. Mundo Científico 1 (8): 913-920, 1985. 7. Bouchez M., Blanchet D.y Vandecasteele J. P. Substrate availability phenantrene biodegradation: transfer mechanism and influence on metabolism, Appl. Microb. Biotechnol., Oct. 43(5):952-960, 1995. 8. Sirvins, A. y Tramier, B. Biodegradation of hydrocarbons. Recherche 16 (171), 1985. 9. Bellota M., Fonseca E.L., Núñez R.R., Martínez J., Villaverde M. J., Joseph N.y Fuentes M. Bioproducto para combatir la contaminación por hidrocarburos de petróleo y sus derivados, Certificado #22323, C12N, 11/02 : CO2F 3/34, 1994. 10. Núñez, R. R.; Oramas, J; Fonseca, E.L.; López, J.S.; Ortiz, E.; Barbán, O.; Cabranes, Y y Martínez, C. Informe del proyecto ejecutivo de CESIGMA SA. Aplicación de la Biorremediación para mitigar los efectos de un derrame de petróleo en la Playa Jibacoa, 2001. 11. Joseph, N.; Capó, M.C.; Bellota, M.; Ramos, Y. y Fuentes, M. Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana. Ciencias Biológicas. Microbiología. 27:137-148, 1994. 12. Gorbienko Y. A. Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos, Mikrobiol, 30(1):168-172, 1961. 13. Núñez R. Obtención del bioproducto IDO-225 para combatir derrames de petróleo en el mar, Tesis para optar por el Título de Maestro en Ciencias. Universidad de La Habana, 1998. 14. Dubois, M., Gilles, K. A.., Hamilton, J. K.., Rebers, P. A. y Smith, F. Colorimetric method of determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350, 1956. 15. Lerch G. La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas, Editorial Científico Técnica. La Habana. Capítulo 16: Análisis de Varianza. Clasificación triple: 251-277, 1977. 16. Duncan D. R. Multiple range multiple F-Test biometrics, 11:1-42, 1965. 17. Head I. Bioremediation: toward a credible technology, Microbiology, 144: 599-608, 1998. 18. Núñez, R.R. Biorremediación de derrame de hidrocarburos en ecosistemas marinos. Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano. Tesis de Doctorado, 2002. 19. Núñez, R.R.; Cabranes, Y.; Ortiz, E.; Gondres, R.; Martínez, C.y Martínez, J. Cinética de degradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus cepa IDO-225. Avicennia (en prensa), 2002. 20. Lehninger .A. Bioquímica. Ed. Revolucionaria. Cap.18, 19 y 20. 487-570pp., 1986. 21. Omar S.H.; Buedecker U. y Rehm H.J. Degradation of oily sludge from a flotation unit by free and inmovilized microorganism,. Appl. Microbiol. Biotechnol, 34(2):259-263, 1990.

Núñez,R.R.*; Cabranes, Y.*; Ortiz, E.*; Gondres, R.**; Martínez, C.*; Martínez, J.

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Extracto BM 21

2010-04-29T14:50:46Z

MiguelAngel cebimar:

'''BM21, un extracto de origen marino con actividad antienvejecimiento, antioxidante, beneficioso para formulaciones cosméticas''' 

Los productos naturales en especial los de origen marino tienen en la actualidad un gran uso en la industria de los cosméticos y buena aceptación por parte de la población. Con el presente trabajo se llevo a cabo la obtención caracterización química y evaluación biológica de un extracto (BM21) de una planta marina con lo que se demostraron sus propiedades beneficiosas para el cuidado de la piel.

Estos resultados muestran la utilidad del extracto a la concentración de 50 mg/g. para eliminar o aliviar las lesiones del fotoenvejecimiento, lo cual ha sido probado en los ratones Balb/c  Además se demuestra que el extracto BM21 tiene efectos antienvejecimiento y antioxidante , no es tóxico, cumple con los requisitos microbiológico y mantiene estable sus características físico - químicas por todo esto este extracto está apto para su utilización como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas. 

== '''Utilización de productos naturales de origen marino''' ==

A nivel mundial la utilización de productos naturales de origen marino en la industria de los cosméticos ha ido en aumento, teniendo en cuenta la creciente necesidad de satisfacer los más exigentes gustos de las mujeres y los hombres con una expectativa de vida mucho mayor y por lo tanto, con nuevos requerimientos en aras de preservar en lo posible la apariencia física, para mitigar los efectos del envejecimiento y de las afectaciones que el ambiente pueda causar a la piel y al cabello. Por tal motivo se han investigado y evaluado los efectos de diversos compuestos naturales y en particular de origen marino con el propósito de obtener nuevos aditivos con propiedades biológicas bien definidas (1[[Título del enlace|Título del enlace]]) (Hao ; Wang, Y. Y Li, X. 1989; Dunlap, W.C.; Chalker, B.E.; Bandaranayake, W.M. y Won, J.,1998;). Muchos extractos de gran variedad de algas han sido ofrecidos como aditivos para el cuidado de la piel y el pelo, estos aditivos principalmente polisacáridos y taninos han sido aplicados como antioxidantes, bacteriostáticos, humectantes y bloqueadores UV ([[2]])(Fenical W., 2001). Cuba como archipiélago tropical posee una gran diversidad biológica en sus fondos marinos factibles de explotar sin afectaciones para el medio ambiente. Este trabajo aborda la obtención de un extracto de una planta marina denominado BM21 el cual fue caracterizado caracterizado químicamente y evaluado biológica y toxicológicamente con perspectivas de aplicación como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas.

== '''Materiales y métodos''' ==

'''Obtención y caracterización de la planta y extracto''': La planta una vez colectada, se separa del material extraño y se somete a secado en estufa a 40 °C por 48 horas. La caracterización preliminar de la planta marina incluyó la determinación de los siguientes parámetros: humedad inicial, materia orgánica, materia seca, nitrógeno proteico, cenizas y metales pesados. El extracto BM21 es obtenido a partir de la trituración de las hojas, las que se someten a maceración a temperatura ambiente en una mezcla que contiene etanol (95%)- agua a partes iguales, con una relación material sólido / disolvente entre 50-100 g/l.. El líquido obtenido después de la filtración se adiciona a una masa de material vegetal nueva repitiéndose el proceso en las mismas condiciones. Seguidamente se somete a filtración y se obtiene el extracto fluido. 

'''Evaluaciones biológicas del extracto BM21:''' Modelo animal de fotoenvejecimiento y su correlación con estudios histológicos.Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c, con peso promedio de 26g. Los ratones fueron depilados en la región dorsal del cuerpo (2x2 cm), con una crema depilatoria comercial, formando grupos de seis animales como se describe en la tabla 1. 

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Todos los animales excepto los controles del grupo I recibieron radiaciones ultravioleta (UV)A y B con una lámpara Spectroline®, por un intervalo de 30 minutos, a 30 cm de la fuente, cada grupo fue irradiado por separado. La dosis de radiación recibida por los animales fue aproximadamente de 23 joule /cm2 de piel. Posterior a las irradiaciones comienza el tratamiento con el extracto BM21, que se aplicó durante cinco días incluyendo el día de irradiación; dos veces al día, en la piel de la región dorsal ya depilada e irradiada Diariamente se realizaron observaciones macroscópicas a los animales a partir de las 24 horas de iniciado el ensayo, hasta el quinto día. Se analizó la posible presencia o no de alteraciones dérmicas como eritema (enrojecimiento), aparición de lesiones costro-descamativas, aspereza y arrugamiento de la piel del lomo.

'''Evaluaciones bioquímicas. Determinación de la actividad superóxido dismutasa (SOD):'''

El extracto BM21fue evaluado por el método descrito por ([[3]]) Fridovich, (1970) que se basa en la inhibición de la formación de radicales O2- generados por el sistema xantina –xantina oxidasa; estos radicales reducen el azul de nitrotetrazolio (NBT) y se forma el formazán. El extracto liofilizado se preparó a una concentración de 2mg/ml en un volumen de mezcla reaccionante. Se evaluaron diferentes concentraciones del extracto, monitoreándose las reacciones espectrofotómetricamente a una longitud de onda de 560 nm. Se determinó el porciento de inhibición para cada concentración con relación a una curva control obtenida en ausencia del extracto, hallándose la CI50. '''Evaluaciones Toxicológicas:''' En todo casos se siguieron los procedimientos descritos por la Organización Económica para la Cooperación y el Desarrollo (OECD). Irritabilidad Dérmica: Se emplearon 10 ratas de ambos sexos. Se aplicó a cada animal una dosis tópica del extracto de 2000mg/g de peso sobre la piel depilada durante 24 horas. ([[4]])OECD, 1987. Irritabilidad Oftálmica: Para este ensayo se utilizaron conejos machos de 2Kg de peso y se calculó el índice de irritación ocular después de aplicar 0.1g del extracto. ([[5]])OECD, 1993 Prueba de sensibilización: En este ensayo se usaron 16 curieles albinos de la línea Hartley de 250g de ambos sexos, con aplicaciones de 0.5 del extracto por 48 horas.([[6]]) OECD, 1992.

''''''Microbiología''':''' Se realizaron determinaciones cuantitativas de : microorganismos aerobios mesófilos , coliformes totales, hongos, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa .

'''Estudio de estabilidad (Vida de estante)'''

Se estudiaron 6 lotes de producto en el tiempo los 0 y 3, 6, 9 y 12 meses, siguiendo las características organolépticas y físico-químicas, determinando el contenido de polifenoles en base al ácido tánico como principal parámetro a seguir.

''''''Evaluaciones biológicas del extracto BM21:''''Modelo animal de fotoenvejecimiento:'''

Se utilizaron tres concentraciones del extracto BM21 (25, 50 y 100 mg de extracto/g de vehículo).

'''Observaciones Macroscópicas:'''

El grupo I, sin alteraciones, sirvió para comparar las estructuras normales de la piel. Grupo II y III aparecieron las alteraciones características del fotoenvejecimiento: eritema, arrugamiento de la piel y lesiones costro-descamativas Grupo IV, V(C1) y V(C2), se observó daño en las estructuras dérmicas y epidérmicas así como la recuperación del daño posterior al tratamiento. El grupo V(C1) se comportó como los grupos II Y III.

'''Observaciones Microscópicas:'''

Se observan alteraciones características del fotoenvejecimiento con marcada significación en la desorganización de la fibra colágena en los grupos controles (II y III) no tratado con el extracto. 

Autores como([[7]]) Davis et al., (1997); Beissert y Granstein (1996); Haratake, Behida, Mimura, Elias y Holleran (1997), entre otros, han analizado, mediante modelos biológicos similares, las diferentes manifestaciones histopatológicas presentes en el fotoenvejecimiento, dentro de las que se pueden citar principalmente: engrosamiento del estrato córneo (hiperqueratosis), engrosamiento de la capa epidérmica (acantosis), infiltrado inflamatorio, aumento y desorganización de las fibras colágenas. aumento de la cantidad de fibras elásticas (elastosis). congestión de los vasos sanguíneos, entre otras. Por otra parte, según ([[8]]) Taylor y Sober (1996); Glogav (1996); los efectos acumulativos de las radiaciones ultravioletas son responsables de diversas alteraciones de la piel, que se pueden manifestar clínicamente en la superficie cutánea en forma de: eritema (enrojecimiento), lesiones costro-descamativas, arrugamiento de la piel, sequedad y aspereza. Nuestros resultados coinciden con los antes planteados, ya que los ratones Balb/c, nos han permitido observar las distintas manifestaciones características del fotoenvejecimiento, lo cual avala la utilidad del modelo usado para este tipo de estudio. Son varios los ensayos que han utilizado modelos de fotoenvejecimiento, para la evaluación de sustancias con posible acción reparadora de la piel, debido a los daños inducidos por las radiaciones ultravioletas, entre ellos, el ácido retinoico, que regeneran las fibras y estimulan la síntesis del colágeno([[9]]) ( Kligman y Chen, 1984; Idson , 1995; Fisher, GJ, Data S, Wang Z, Li XY, Quant T, Chung JH, Kang S, Voorhees JJ 2000). También se han encontrado resultados muy alentadores, obtenidos a partir de varios extractos de organismos marinos, fundamentalmente algas, que poseen elementos como -carotenos, efectivos para estos tratamientos ([[10]]) (Goldemberg, 1995a y Yutaka, 1995). Los resultados de los grupos II y III (depilados e irradiados y depilados irradiados y tratados con el ungüento hidrófilo), muestran características similares a las descritas para el fotoenvejecimiento ya que se observa pérdida y desorganización de las fibras colágenas., elastosis, acantosis y otras alteraciones en la dermis y epidermis. Estas patologías no aparecieron en el grupo I (control); ni en los grupos IV, y V(C2 y C3), tratados con la crema patrón y el extracto BM21 a concentraciones de 50 y 100 mg/g respectivamente.

'''Evaluaciones toxicológicas'''

'''Determinación de Irritabilidad Dérmica:''' El producto estudiado no produjo toxicidad observable en los animales de experimentación cuando se emplea la dosis de 2000mg/Kg, o sea, según la clasificación de la Unión Europea se encuentra en la categoría de sin clasificar, por lo que se considera potencialmente NO tóxico para el humano. '''Determinación de Irritabilidad Oftálmica: ''' El producto produce una irritación ligera en la conjuntiva no así en las otras estructuras oculares analizadas (córnea e iris) durante el primer día del ensayo por lo que clasifica como NO irritante. '''Prueba de Sensibilización: ''' El producto no es alérgeno potencial de acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba ya que pasó satisfactoriamente el ensayo de sensibilización de acuerdo con el procedimiento descrito, el cual es empleado como rutina en estas evaluaciones toxicológicas

'''Microbiología:'''

Límite de contaminantes microbiológicos: Microorganismos aerobios mesófilos ,(<10) Coliformes totales (<10), Hongos (<10), Staphylococcus aureus (Negativo) Y Pseudomonas aeruginosa (Negativo). Estos resultados muestran que el extracto cumple con los límites microbianos que exige la Norma Cubana para las materias primas para cosméticos.

'''Estudio de estabilidad (Vida de estante)'''

En el período de 12 meses la concentración de polifenoles permaneció sin variación, siendo entre 0.27% ± 0.02, por lo que se demuestra que el BM21 puede ser conservado hasta 12 meses después de su fabricación sin sufrir ninguna degradación apreciable, ya que mantiene sus características organolépticas, químicas y físicas lo que permite emplearlo como materia prima para cosméticos, recomendándose, conservarlo en envases plásticos de polietileno de alta densidad a temperatura ambiente.

'''Bibliografía.'''

 (7)Davis, S.; Lopjoch, L.; Kerr, N. Y Fedesejirs, R. (1997). Clothing as protection from UV radiation: which fabric is most effective?. Int. J. Dermatol. 36(5). 374 pp. (2)Fenical, W. (2001). Eploring marine derived ingredients for personal care. Cosmetic and Toletries 116(2):33-37 (3)Fridovich, I. (1970) Quantitative aspect of the production of superoxide anion radical by milk xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 245, 4053-4057. (10)Goldemberg, R.L. (1995a). Coumpounders from the sea. Drug and Cosmetic Industry. 7: 56-61. (10)Goldemberg, R.L. (1995b). Functional aging. Drug and Cosmetic Industry. 7: 68-71. (7)Haratake, A.; Uchida, Y.; Mimura, K.; Elias, P. M. Y Holleran, W. M. (1997). Intrinsically aged epidermis displays diminished UVB-induced alteration in barrier function associated with decrease proliferation. The Journal of Investigative Dermatology. 108(3): 319-323. (1)Hao, Z.; Wang, Y. Y Li, X. (1989). Slimning effects of chinese herbal extracts. Cosmetics and Toiletries. 6(10): 67-69. Idson, B. (1995). Treatment cosmetics II. Retinoids and ahas. Drug and cosmetics Industry: 7(4): 25-28 .ISO 10993, 1992. ISO Part 10, 1999.. Biological Evaluation of Medical Devices. (9)Kligman, L.H.; Chen, H.D. y Kligman, A.M. (1984). Topical retinoid acid enhances the repair of ultraviolet damaged connective tissue. Connect Tiss Res. 17(12): 139-150.NC 95-24:86 Perfumería y Cosméticos. Limites microbiano. Determinaciones. (4)OECD, 1987.Guidelines for testing of chemicals.. 401.Toxicidad Aguda Dérmica. (5)OECD, 1992. Guidelines for testing of chemicals.. TG406. Sensibilization test. (6)OECD, 1993. Guidelines for testing of chemicals. 405. Irritación Oftálmica. (8)Taylor, C.R. y Sober, A.J. (1996). Sun exposure and skin disease. Annv. Rev. Med. 47: 181-191. (10)Yutaka, H. (1995). Promotor for biological hyaluronic acid synthesis, composition externally applied to the skin and use thereof. European Patent Application, publication number 0531978#2.

María Rodríguez García*, Felix Arteaga Silberstein*, Olga Valdés Iglesias*, Miguel D. Fernández Pérez*

Centro de Bioproductos Marinos    http//:www.medioambiente.cu

 

 

 

 

 

 

[[Category:Microbiología]] [[Category:Biología_molecular]] [[Category:Toxicología]]

Extracto BM 21

2010-04-29T14:46:18Z

MiguelAngel cebimar:

'''BM21, un extracto de origen marino con actividad antienvejecimiento, antioxidante, beneficioso para formulaciones cosméticas''' 

Los productos naturales en especial los de origen marino tienen en la actualidad un gran uso en la industria de los cosméticos y buena aceptación por parte de la población. Con el presente trabajo se llevo a cabo la obtención caracterización química y evaluación biológica de un extracto (BM21) de una planta marina con lo que se demostraron sus propiedades beneficiosas para el cuidado de la piel.

Estos resultados muestran la utilidad del extracto a la concentración de 50 mg/g. para eliminar o aliviar las lesiones del fotoenvejecimiento, lo cual ha sido probado en los ratones Balb/c  Además se demuestra que el extracto BM21 tiene efectos antienvejecimiento y antioxidante , no es tóxico, cumple con los requisitos microbiológico y mantiene estable sus características físico - químicas por todo esto este extracto está apto para su utilización como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas. 

== '''Utilización de productos naturales de origen marino''' ==

A nivel mundial la utilización de productos naturales de origen marino en la industria de los cosméticos ha ido en aumento, teniendo en cuenta la creciente necesidad de satisfacer los más exigentes gustos de las mujeres y los hombres con una expectativa de vida mucho mayor y por lo tanto, con nuevos requerimientos en aras de preservar en lo posible la apariencia física, para mitigar los efectos del envejecimiento y de las afectaciones que el ambiente pueda causar a la piel y al cabello. Por tal motivo se han investigado y evaluado los efectos de diversos compuestos naturales y en particular de origen marino con el propósito de obtener nuevos aditivos con propiedades biológicas bien definidas (1[[Título del enlace]]) (Hao ; Wang, Y. Y Li, X. 1989; Dunlap, W.C.; Chalker, B.E.; Bandaranayake, W.M. y Won, J.,1998;). Muchos extractos de gran variedad de algas han sido ofrecidos como aditivos para el cuidado de la piel y el pelo, estos aditivos principalmente polisacáridos y taninos han sido aplicados como antioxidantes, bacteriostáticos, humectantes y bloqueadores UV ([[2]])(Fenical W., 2001). Cuba como archipiélago tropical posee una gran diversidad biológica en sus fondos marinos factibles de explotar sin afectaciones para el medio ambiente. Este trabajo aborda la obtención de un extracto de una planta marina denominado BM21 el cual fue caracterizado caracterizado químicamente y evaluado biológica y toxicológicamente con perspectivas de aplicación como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas.

== '''Materiales y métodos''' ==

'''Obtención y caracterización de la planta y extracto''': La planta una vez colectada, se separa del material extraño y se somete a secado en estufa a 40 °C por 48 horas. La caracterización preliminar de la planta marina incluyó la determinación de los siguientes parámetros: humedad inicial, materia orgánica, materia seca, nitrógeno proteico, cenizas y metales pesados. El extracto BM21 es obtenido a partir de la trituración de las hojas, las que se someten a maceración a temperatura ambiente en una mezcla que contiene etanol (95%)- agua a partes iguales, con una relación material sólido / disolvente entre 50-100 g/l.. El líquido obtenido después de la filtración se adiciona a una masa de material vegetal nueva repitiéndose el proceso en las mismas condiciones. Seguidamente se somete a filtración y se obtiene el extracto fluido. 

'''Evaluaciones biológicas del extracto BM21:''' Modelo animal de fotoenvejecimiento y su correlación con estudios histológicos.Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c, con peso promedio de 26g. Los ratones fueron depilados en la región dorsal del cuerpo (2x2 cm), con una crema depilatoria comercial, formando grupos de seis animales como se describe en la tabla 1. 

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Todos los animales excepto los controles del grupo I recibieron radiaciones ultravioleta (UV)A y B con una lámpara Spectroline®, por un intervalo de 30 minutos, a 30 cm de la fuente, cada grupo fue irradiado por separado. La dosis de radiación recibida por los animales fue aproximadamente de 23 joule /cm2 de piel. Posterior a las irradiaciones comienza el tratamiento con el extracto BM21, que se aplicó durante cinco días incluyendo el día de irradiación; dos veces al día, en la piel de la región dorsal ya depilada e irradiada Diariamente se realizaron observaciones macroscópicas a los animales a partir de las 24 horas de iniciado el ensayo, hasta el quinto día. Se analizó la posible presencia o no de alteraciones dérmicas como eritema (enrojecimiento), aparición de lesiones costro-descamativas, aspereza y arrugamiento de la piel del lomo.

'''Evaluaciones bioquímicas. Determinación de la actividad superóxido dismutasa (SOD):'''

El extracto BM21fue evaluado por el método descrito por ([[3]]) Fridovich, (1970) que se basa en la inhibición de la formación de radicales O2- generados por el sistema xantina –xantina oxidasa; estos radicales reducen el azul de nitrotetrazolio (NBT) y se forma el formazán. El extracto liofilizado se preparó a una concentración de 2mg/ml en un volumen de mezcla reaccionante. Se evaluaron diferentes concentraciones del extracto, monitoreándose las reacciones espectrofotómetricamente a una longitud de onda de 560 nm. Se determinó el porciento de inhibición para cada concentración con relación a una curva control obtenida en ausencia del extracto, hallándose la CI50. '''Evaluaciones Toxicológicas:''' En todo casos se siguieron los procedimientos descritos por la Organización Económica para la Cooperación y el Desarrollo (OECD). Irritabilidad Dérmica: Se emplearon 10 ratas de ambos sexos. Se aplicó a cada animal una dosis tópica del extracto de 2000mg/g de peso sobre la piel depilada durante 24 horas. ([[4]])OECD, 1987. Irritabilidad Oftálmica: Para este ensayo se utilizaron conejos machos de 2Kg de peso y se calculó el índice de irritación ocular después de aplicar 0.1g del extracto. ([[5]])OECD, 1993 Prueba de sensibilización: En este ensayo se usaron 16 curieles albinos de la línea Hartley de 250g de ambos sexos, con aplicaciones de 0.5 del extracto por 48 horas.([[6]]) OECD, 1992.

''''''Microbiología''':''' Se realizaron determinaciones cuantitativas de : microorganismos aerobios mesófilos , coliformes totales, hongos, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa .

'''Estudio de estabilidad (Vida de estante)'''

Se estudiaron 6 lotes de producto en el tiempo los 0 y 3, 6, 9 y 12 meses, siguiendo las características organolépticas y físico-químicas, determinando el contenido de polifenoles en base al ácido tánico como principal parámetro a seguir.

''''''Evaluaciones biológicas del extracto BM21:''''''''Modelo animal de fotoenvejecimiento:''''

Se utilizaron tres concentraciones del extracto BM21 (25, 50 y 100 mg de extracto/g de vehículo).

'''Observaciones Macroscópicas:'''

El grupo I, sin alteraciones, sirvió para comparar las estructuras normales de la piel. Grupo II y III aparecieron las alteraciones características del fotoenvejecimiento: eritema, arrugamiento de la piel y lesiones costro-descamativas Grupo IV, V(C1) y V(C2), se observó daño en las estructuras dérmicas y epidérmicas así como la recuperación del daño posterior al tratamiento. El grupo V(C1) se comportó como los grupos II Y III.

'''Observaciones Microscópicas:'''

Se observan alteraciones características del fotoenvejecimiento con marcada significación en la desorganización de la fibra colágena en los grupos controles (II y III) no tratado con el extracto. 

Autores como([[7]]) Davis et al., (1997); Beissert y Granstein (1996); Haratake, Behida, Mimura, Elias y Holleran (1997), entre otros, han analizado, mediante modelos biológicos similares, las diferentes manifestaciones histopatológicas presentes en el fotoenvejecimiento, dentro de las que se pueden citar principalmente: engrosamiento del estrato córneo (hiperqueratosis), engrosamiento de la capa epidérmica (acantosis), infiltrado inflamatorio, aumento y desorganización de las fibras colágenas. aumento de la cantidad de fibras elásticas (elastosis). congestión de los vasos sanguíneos, entre otras. Por otra parte, según ([[8]]) Taylor y Sober (1996); Glogav (1996); los efectos acumulativos de las radiaciones ultravioletas son responsables de diversas alteraciones de la piel, que se pueden manifestar clínicamente en la superficie cutánea en forma de: eritema (enrojecimiento), lesiones costro-descamativas, arrugamiento de la piel, sequedad y aspereza. Nuestros resultados coinciden con los antes planteados, ya que los ratones Balb/c, nos han permitido observar las distintas manifestaciones características del fotoenvejecimiento, lo cual avala la utilidad del modelo usado para este tipo de estudio. Son varios los ensayos que han utilizado modelos de fotoenvejecimiento, para la evaluación de sustancias con posible acción reparadora de la piel, debido a los daños inducidos por las radiaciones ultravioletas, entre ellos, el ácido retinoico, que regeneran las fibras y estimulan la síntesis del colágeno([[9]]) ( Kligman y Chen, 1984; Idson , 1995; Fisher, GJ, Data S, Wang Z, Li XY, Quant T, Chung JH, Kang S, Voorhees JJ 2000). También se han encontrado resultados muy alentadores, obtenidos a partir de varios extractos de organismos marinos, fundamentalmente algas, que poseen elementos como -carotenos, efectivos para estos tratamientos ([[10]]) (Goldemberg, 1995a y Yutaka, 1995). Los resultados de los grupos II y III (depilados e irradiados y depilados irradiados y tratados con el ungüento hidrófilo), muestran características similares a las descritas para el fotoenvejecimiento ya que se observa pérdida y desorganización de las fibras colágenas., elastosis, acantosis y otras alteraciones en la dermis y epidermis. Estas patologías no aparecieron en el grupo I (control); ni en los grupos IV, y V(C2 y C3), tratados con la crema patrón y el extracto BM21 a concentraciones de 50 y 100 mg/g respectivamente.

'''Evaluaciones toxicológicas'''

'''Determinación de Irritabilidad Dérmica:''' El producto estudiado no produjo toxicidad observable en los animales de experimentación cuando se emplea la dosis de 2000mg/Kg, o sea, según la clasificación de la Unión Europea se encuentra en la categoría de sin clasificar, por lo que se considera potencialmente NO tóxico para el humano. '''Determinación de Irritabilidad Oftálmica: ''' El producto produce una irritación ligera en la conjuntiva no así en las otras estructuras oculares analizadas (córnea e iris) durante el primer día del ensayo por lo que clasifica como NO irritante. '''Prueba de Sensibilización: ''' El producto no es alérgeno potencial de acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba ya que pasó satisfactoriamente el ensayo de sensibilización de acuerdo con el procedimiento descrito, el cual es empleado como rutina en estas evaluaciones toxicológicas

'''Microbiología:'''

Límite de contaminantes microbiológicos: Microorganismos aerobios mesófilos ,(<10) Coliformes totales (<10), Hongos (<10), Staphylococcus aureus (Negativo) Y Pseudomonas aeruginosa (Negativo). Estos resultados muestran que el extracto cumple con los límites microbianos que exige la Norma Cubana para las materias primas para cosméticos.

'''Estudio de estabilidad (Vida de estante)'''

En el período de 12 meses la concentración de polifenoles permaneció sin variación, siendo entre 0.27% ± 0.02, por lo que se demuestra que el BM21 puede ser conservado hasta 12 meses después de su fabricación sin sufrir ninguna degradación apreciable, ya que mantiene sus características organolépticas, químicas y físicas lo que permite emplearlo como materia prima para cosméticos, recomendándose, conservarlo en envases plásticos de polietileno de alta densidad a temperatura ambiente.

'''Bibliografía.'''

 (7)Davis, S.; Lopjoch, L.; Kerr, N. Y Fedesejirs, R. (1997). Clothing as protection from UV radiation: which fabric is most effective?. Int. J. Dermatol. 36(5). 374 pp. (2)Fenical, W. (2001). Eploring marine derived ingredients for personal care. Cosmetic and Toletries 116(2):33-37 (3)Fridovich, I. (1970) Quantitative aspect of the production of superoxide anion radical by milk xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 245, 4053-4057. (10)Goldemberg, R.L. (1995a). Coumpounders from the sea. Drug and Cosmetic Industry. 7: 56-61. (10)Goldemberg, R.L. (1995b). Functional aging. Drug and Cosmetic Industry. 7: 68-71. (7)Haratake, A.; Uchida, Y.; Mimura, K.; Elias, P. M. Y Holleran, W. M. (1997). Intrinsically aged epidermis displays diminished UVB-induced alteration in barrier function associated with decrease proliferation. The Journal of Investigative Dermatology. 108(3): 319-323. (1)Hao, Z.; Wang, Y. Y Li, X. (1989). Slimning effects of chinese herbal extracts. Cosmetics and Toiletries. 6(10): 67-69. Idson, B. (1995). Treatment cosmetics II. Retinoids and ahas. Drug and cosmetics Industry: 7(4): 25-28 .ISO 10993, 1992. ISO Part 10, 1999.. Biological Evaluation of Medical Devices. (9)Kligman, L.H.; Chen, H.D. y Kligman, A.M. (1984). Topical retinoid acid enhances the repair of ultraviolet damaged connective tissue. Connect Tiss Res. 17(12): 139-150.NC 95-24:86 Perfumería y Cosméticos. Limites microbiano. Determinaciones. (4)OECD, 1987.Guidelines for testing of chemicals.. 401.Toxicidad Aguda Dérmica. (5)OECD, 1992. Guidelines for testing of chemicals.. TG406. Sensibilization test. (6)OECD, 1993. Guidelines for testing of chemicals. 405. Irritación Oftálmica. (8)Taylor, C.R. y Sober, A.J. (1996). Sun exposure and skin disease. Annv. Rev. Med. 47: 181-191. (10)Yutaka, H. (1995). Promotor for biological hyaluronic acid synthesis, composition externally applied to the skin and use thereof. European Patent Application, publication number 0531978#2.

María Rodríguez García*, Felix Arteaga Silberstein*, Olga Valdés Iglesias*, Miguel D. Fernández Pérez*

Centro de Bioproductos Marinos    http//:www.medioambiente.cu

 

 

 

 

 

 

[[Category:Microbiología]] [[Category:Biología_molecular]] [[Category:Toxicología]]

Extracto BM 21

2010-04-29T14:37:00Z

MiguelAngel cebimar: Página creada con ' '''BM21, un extracto de origen marino con actividad antienvejecimiento, antioxidante, beneficioso para formulaciones cosméticas''' Los productos naturales en espec…'

'''BM21, un extracto de origen marino con actividad antienvejecimiento, antioxidante, beneficioso para formulaciones cosméticas''' 

Los productos naturales en especial los de origen marino tienen en la actualidad un gran uso en la industria de los cosméticos y buena aceptación por parte de la población. Con el presente trabajo se llevo a cabo la obtención caracterización química y evaluación biológica de un extracto (BM21) de una planta marina con lo que se demostraron sus propiedades beneficiosas para el cuidado de la piel.

Estos resultados muestran la utilidad del extracto a la concentración de 50 mg/g. para eliminar o aliviar las lesiones del fotoenvejecimiento, lo cual ha sido probado en los ratones Balb/c  Además se demuestra que el extracto BM21 tiene efectos antienvejecimiento y antioxidante , no es tóxico, cumple con los requisitos microbiológico y mantiene estable sus características físico - químicas por todo esto este extracto está apto para su utilización como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas. 

== '''Utilización de productos naturales de origen marino''' ==

A nivel mundial la utilización de productos naturales de origen marino en la industria de los cosméticos ha ido en aumento, teniendo en cuenta la creciente necesidad de satisfacer los más exigentes gustos de las mujeres y los hombres con una expectativa de vida mucho mayor y por lo tanto, con nuevos requerimientos en aras de preservar en lo posible la apariencia física, para mitigar los efectos del envejecimiento y de las afectaciones que el ambiente pueda causar a la piel y al cabello. Por tal motivo se han investigado y evaluado los efectos de diversos compuestos naturales y en particular de origen marino con el propósito de obtener nuevos aditivos con propiedades biológicas bien definidas (1) (Hao ; Wang, Y. Y Li, X. 1989; Dunlap, W.C.; Chalker, B.E.; Bandaranayake, W.M. y Won, J.,1998;). Muchos extractos de gran variedad de algas han sido ofrecidos como aditivos para el cuidado de la piel y el pelo, estos aditivos principalmente polisacáridos y taninos han sido aplicados como antioxidantes, bacteriostáticos, humectantes y bloqueadores UV (2)(Fenical W., 2001). Cuba como archipiélago tropical posee una gran diversidad biológica en sus fondos marinos factibles de explotar sin afectaciones para el medio ambiente. Este trabajo aborda la obtención de un extracto de una planta marina denominado BM21 el cual fue caracterizado caracterizado químicamente y evaluado biológica y toxicológicamente con perspectivas de aplicación como aditivo bioactivo para formulaciones cosméticas.

== '''Materiales y métodos''' ==

'''Obtención y caracterización de la planta y extracto''': La planta una vez colectada, se separa del material extraño y se somete a secado en estufa a 40 °C por 48 horas. La caracterización preliminar de la planta marina incluyó la determinación de los siguientes parámetros: humedad inicial, materia orgánica, materia seca, nitrógeno proteico, cenizas y metales pesados. El extracto BM21 es obtenido a partir de la trituración de las hojas, las que se someten a maceración a temperatura ambiente en una mezcla que contiene etanol (95%)- agua a partes iguales, con una relación material sólido / disolvente entre 50-100 g/l.. El líquido obtenido después de la filtración se adiciona a una masa de material vegetal nueva repitiéndose el proceso en las mismas condiciones. Seguidamente se somete a filtración y se obtiene el extracto fluido. 

'''Evaluaciones biológicas del extracto BM21:''' Modelo animal de fotoenvejecimiento y su correlación con estudios histológicos.Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c, con peso promedio de 26g. Los ratones fueron depilados en la región dorsal del cuerpo (2x2 cm), con una crema depilatoria comercial, formando grupos de seis animales como se describe en la tabla 1. 

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Grupo Clasificación Descripción I Control Depilados solamente. Para observar las caracteristicas normales de la piel. II Control Depilados, irradiados. Control de los daños causados por la irradiación. III Control Depilados, irradiados y tratados con el vehículo IV Control Depilados, irradiados y tratados con una crema comercial antienvejecimiento V (C1) Experimental Depilados, irradiados y tratados con la concentración de 25mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C2) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 50mg de extracto BM21 /g de vehículo. V (C3) Experimental Depilados, irradiados y tratados con 100mg de extracto BM21 /g de vehículo.

Todos los animales excepto los controles del grupo I recibieron radiaciones ultravioleta (UV)A y B con una lámpara Spectroline®, por un intervalo de 30 minutos, a 30 cm de la fuente, cada grupo fue irradiado por separado. La dosis de radiación recibida por los animales fue aproximadamente de 23 joule /cm2 de piel. Posterior a las irradiaciones comienza el tratamiento con el extracto BM21, que se aplicó durante cinco días incluyendo el día de irradiación; dos veces al día, en la piel de la región dorsal ya depilada e irradiada Diariamente se realizaron observaciones macroscópicas a los animales a partir de las 24 horas de iniciado el ensayo, hasta el quinto día. Se analizó la posible presencia o no de alteraciones dérmicas como eritema (enrojecimiento), aparición de lesiones costro-descamativas, aspereza y arrugamiento de la piel del lomo.

'''Evaluaciones bioquímicas. Determinación de la actividad superóxido dismutasa (SOD):'''

El extracto BM21fue evaluado por el método descrito por (3) Fridovich, (1970) que se basa en la inhibición de la formación de radicales O2- generados por el sistema xantina –xantina oxidasa; estos radicales reducen el azul de nitrotetrazolio (NBT) y se forma el formazán. El extracto liofilizado se preparó a una concentración de 2mg/ml en un volumen de mezcla reaccionante. Se evaluaron diferentes concentraciones del extracto, monitoreándose las reacciones espectrofotómetricamente a una longitud de onda de 560 nm. Se determinó el porciento de inhibición para cada concentración con relación a una curva control obtenida en ausencia del extracto, hallándose la CI50. '''Evaluaciones Toxicológicas:''' En todo casos se siguieron los procedimientos descritos por la Organización Económica para la Cooperación y el Desarrollo (OECD). Irritabilidad Dérmica: Se emplearon 10 ratas de ambos sexos. Se aplicó a cada animal una dosis tópica del extracto de 2000mg/g de peso sobre la piel depilada durante 24 horas. (4)OECD, 1987. Irritabilidad Oftálmica: Para este ensayo se utilizaron conejos machos de 2Kg de peso y se calculó el índice de irritación ocular después de aplicar 0.1g del extracto. (5)OECD, 1993 Prueba de sensibilización: En este ensayo se usaron 16 curieles albinos de la línea Hartley de 250g de ambos sexos, con aplicaciones de 0.5 del extracto por 48 horas.(6) OECD, 1992.

'''Microbiología'''''':''' Se realizaron determinaciones cuantitativas de : microorganismos aerobios mesófilos , coliformes totales, hongos, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa .

Estudio de estabilidad (Vida de estante)

Se estudiaron 6 lotes de producto en el tiempo los 0 y 3, 6, 9 y 12 meses, siguiendo las características organolépticas y físico-químicas, determinando el contenido de polifenoles en base al ácido tánico como principal parámetro a seguir.

'''Evaluaciones biológicas del extracto BM21: '''Modelo animal de fotoenvejecimiento:''''''

Se utilizaron tres concentraciones del extracto BM21 (25, 50 y 100 mg de extracto/g de vehículo).

'''Observaciones Macroscópicas:'''

El grupo I, sin alteraciones, sirvió para comparar las estructuras normales de la piel. Grupo II y III aparecieron las alteraciones características del fotoenvejecimiento: eritema, arrugamiento de la piel y lesiones costro-descamativas Grupo IV, V(C1) y V(C2), se observó daño en las estructuras dérmicas y epidérmicas así como la recuperación del daño posterior al tratamiento. El grupo V(C1) se comportó como los grupos II Y III.

'''Observaciones Microscópicas:'''

Se observan alteraciones características del fotoenvejecimiento con marcada significación en la desorganización de la fibra colágena en los grupos controles (II y III) no tratado con el extracto. 

Autores como(7) Davis et al., (1997); Beissert y Granstein (1996); Haratake, Behida, Mimura, Elias y Holleran (1997), entre otros, han analizado, mediante modelos biológicos similares, las diferentes manifestaciones histopatológicas presentes en el fotoenvejecimiento, dentro de las que se pueden citar principalmente: engrosamiento del estrato córneo (hiperqueratosis), engrosamiento de la capa epidérmica (acantosis), infiltrado inflamatorio, aumento y desorganización de las fibras colágenas. aumento de la cantidad de fibras elásticas (elastosis). congestión de los vasos sanguíneos, entre otras. Por otra parte, según (8) Taylor y Sober (1996); Glogav (1996); los efectos acumulativos de las radiaciones ultravioletas son responsables de diversas alteraciones de la piel, que se pueden manifestar clínicamente en la superficie cutánea en forma de: eritema (enrojecimiento), lesiones costro-descamativas, arrugamiento de la piel, sequedad y aspereza. Nuestros resultados coinciden con los antes planteados, ya que los ratones Balb/c, nos han permitido observar las distintas manifestaciones características del fotoenvejecimiento, lo cual avala la utilidad del modelo usado para este tipo de estudio. Son varios los ensayos que han utilizado modelos de fotoenvejecimiento, para la evaluación de sustancias con posible acción reparadora de la piel, debido a los daños inducidos por las radiaciones ultravioletas, entre ellos, el ácido retinoico, que regeneran las fibras y estimulan la síntesis del colágeno(9) ( Kligman y Chen, 1984; Idson , 1995; Fisher, GJ, Data S, Wang Z, Li XY, Quant T, Chung JH, Kang S, Voorhees JJ 2000). También se han encontrado resultados muy alentadores, obtenidos a partir de varios extractos de organismos marinos, fundamentalmente algas, que poseen elementos como -carotenos, efectivos para estos tratamientos (10) (Goldemberg, 1995a y Yutaka, 1995). Los resultados de los grupos II y III (depilados e irradiados y depilados irradiados y tratados con el ungüento hidrófilo), muestran características similares a las descritas para el fotoenvejecimiento ya que se observa pérdida y desorganización de las fibras colágenas., elastosis, acantosis y otras alteraciones en la dermis y epidermis. Estas patologías no aparecieron en el grupo I (control); ni en los grupos IV, y V(C2 y C3), tratados con la crema patrón y el extracto BM21 a concentraciones de 50 y 100 mg/g respectivamente.

'''Evaluaciones toxicológicas'''

'''Determinación de Irritabilidad Dérmica:''' El producto estudiado no produjo toxicidad observable en los animales de experimentación cuando se emplea la dosis de 2000mg/Kg, o sea, según la clasificación de la Unión Europea se encuentra en la categoría de sin clasificar, por lo que se considera potencialmente NO tóxico para el humano. '''Determinación de Irritabilidad Oftálmica: ''' El producto produce una irritación ligera en la conjuntiva no así en las otras estructuras oculares analizadas (córnea e iris) durante el primer día del ensayo por lo que clasifica como NO irritante. '''Prueba de Sensibilización: ''' El producto no es alérgeno potencial de acuerdo a los resultados obtenidos en la prueba ya que pasó satisfactoriamente el ensayo de sensibilización de acuerdo con el procedimiento descrito, el cual es empleado como rutina en estas evaluaciones toxicológicas

'''Microbiología:'''

Límite de contaminantes microbiológicos: Microorganismos aerobios mesófilos ,(<10) Coliformes totales (<10), Hongos (<10), Staphylococcus aureus (Negativo) Y Pseudomonas aeruginosa (Negativo). Estos resultados muestran que el extracto cumple con los límites microbianos que exige la Norma Cubana para las materias primas para cosméticos.

'''Estudio de estabilidad (Vida de estante)'''

En el período de 12 meses la concentración de polifenoles permaneció sin variación, siendo entre 0.27% ± 0.02, por lo que se demuestra que el BM21 puede ser conservado hasta 12 meses después de su fabricación sin sufrir ninguna degradación apreciable, ya que mantiene sus características organolépticas, químicas y físicas lo que permite emplearlo como materia prima para cosméticos, recomendándose, conservarlo en envases plásticos de polietileno de alta densidad a temperatura ambiente.

'''Bibliografía.'''

 (7)Davis, S.; Lopjoch, L.; Kerr, N. Y Fedesejirs, R. (1997). Clothing as protection from UV radiation: which fabric is most effective?. Int. J. Dermatol. 36(5). 374 pp. (2)Fenical, W. (2001). Eploring marine derived ingredients for personal care. Cosmetic and Toletries 116(2):33-37 (3)Fridovich, I. (1970) Quantitative aspect of the production of superoxide anion radical by milk xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 245, 4053-4057. (10)Goldemberg, R.L. (1995a). Coumpounders from the sea. Drug and Cosmetic Industry. 7: 56-61. (10)Goldemberg, R.L. (1995b). Functional aging. Drug and Cosmetic Industry. 7: 68-71. (7)Haratake, A.; Uchida, Y.; Mimura, K.; Elias, P. M. Y Holleran, W. M. (1997). Intrinsically aged epidermis displays diminished UVB-induced alteration in barrier function associated with decrease proliferation. The Journal of Investigative Dermatology. 108(3): 319-323. (1)Hao, Z.; Wang, Y. Y Li, X. (1989). Slimning effects of chinese herbal extracts. Cosmetics and Toiletries. 6(10): 67-69. Idson, B. (1995). Treatment cosmetics II. Retinoids and ahas. Drug and cosmetics Industry: 7(4): 25-28 .ISO 10993, 1992. ISO Part 10, 1999.. Biological Evaluation of Medical Devices. (9)Kligman, L.H.; Chen, H.D. y Kligman, A.M. (1984). Topical retinoid acid enhances the repair of ultraviolet damaged connective tissue. Connect Tiss Res. 17(12): 139-150.NC 95-24:86 Perfumería y Cosméticos. Limites microbiano. Determinaciones. (4)OECD, 1987.Guidelines for testing of chemicals.. 401.Toxicidad Aguda Dérmica. (5)OECD, 1992. Guidelines for testing of chemicals.. TG406. Sensibilization test. (6)OECD, 1993. Guidelines for testing of chemicals. 405. Irritación Oftálmica. (8)Taylor, C.R. y Sober, A.J. (1996). Sun exposure and skin disease. Annv. Rev. Med. 47: 181-191. (10)Yutaka, H. (1995). Promotor for biological hyaluronic acid synthesis, composition externally applied to the skin and use thereof. European Patent Application, publication number 0531978#2.

María Rodríguez García*, Felix Arteaga Silberstein*, Olga Valdés Iglesias*, Miguel D. Fernández Pérez*

Centro de Bioproductos Marinos    http//:www.medioambiente.cu

 

 

 

 

 

 

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Biorremediación de hidrocarburos

2010-04-28T15:54:42Z

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''' Biorremediación de hidrocarburos en ausencia de fuentes de nitrógeno y fósforo'''

El ambiente marino posee una pobre capacidad de respuesta al impacto de los hidrocarburos petrolí-feros, tanto por la baja concentración de nutrientes disponibles (nitrógeno y fósforo), como por la baja frecuencia de aparición de bacterias hidrocarbonoclastas. Teniendo en cuenta la posibilidad que ofrecen las células inmovilizadas de transformar los hidrocarburos del petróleo sin que ocurra dupli-cación celular, en este trabajo se realizó un estudio de la necesidad o no de añadir nutrientes al BIO-IL (producto hidrocarbonoclasta a partir de células inmovilizadas). Se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que no es necesario añadir nutrientes al agua de mar para que ocurra una degradación eficiente de los hidrocarburos del petróleo por parte del BIOIL y que la acción de este producto no se inhibe por altas concentraciones de hidrocarburos (hasta el 8 %).

 BIOIL es efectivo frente a los hidrocarburos del petróleo en ausencia de fuentes de nitrógeno y fósforo lo cual lo hace más económico y menos tóxico al ambiente marino.  Este producto mantiene su capacidad degradadora a altas concentraciones de hidrocarburos (hasta el 8 %) sin añadir nutrientes al medio de transformación. 

== '''La biodegradación microbiana''' ==

La biodegradación microbiana del petróleo es un proceso complejo que consiste en transformarlo en otros compuestos más solubles e inestables. Esta se lleva a cabo por acción de monooxigenasas y dioxigenasas, enzimas que oxidan a los hidrocarburos con incorporación directa de oxígeno molecular (1) (Lee y Levy, 1989). Cada una de estas enzimas controla un paso de las vías metabólicas, por las cuales las sustancias tóxicas son transformadas en productos no tóxicos (2) (Wackett y Ellis, 1998). La inoculación directa de microorganismos degradadores de petróleo, principalmente bacterias, ha sido estudiada como una vía para disminuir las consecuencias nocivas de un derrame. La velocidad de degradación de hidrocarburos es mayor por éste método y además se evitan los metabolitos tóxi-cos que se forman durante el proceso de biodegradación cuando se utilizan fertilizantes orgánicos (3) (Lee y Tremblay, 1995). El uso de células inmovilizadas ofrece una alternativa con respecto a las aplicaciones convenciona-les llevadas a cabo con células libres. Por esta razón en el Instituto de Oceanología se obtuvo un producto de células inmovilizadas patentado y denominado BIOIL  (4) (Bellota et al., 1994). 

== '''Que es el Bioil''' ==

BIOIL: Producto formado por el cultivo mixto A-5 inmovilizado en gel de pectina cítrica. Medio de degradación empleado: Medio Salino (5) (Vela y Ralston, 1978), suplementado con 3% de petróleo Romashkino (32 API). Teniendo en cuenta la posibilidad que ofrecen las células inmovilizadas de transformar los hidrocar-buros del petróleo a través de un mecanismo de bioconversión hasta transformarlo en CO2 y H2O sin necesidad de una duplicación celular, es necesario realizar un estudio de la necesidad o no de añadir nutrientes al BIOIL. El objetivo de éste trabajo fue analizar la necesidad de adicionar nitrógeno y fósforo al medio cuan-do se usa BIOIL en derrames masivos de hidrocarburos en el mar. 

== '''Influencia de la concentración del petróleo en la degradación''' ==

 Se inoculó 1g del producto en agua de mar con petróleo al 8% (v/v) y se realizó la extracción de hidrocarburos residuales a los 30 días. Todos los experimentos se realizaron con petróleo ligero Romashkino, la esterilización se realizó a 121 ºC durante 15 minutos y como control se utilizó medio estéril sin inocular. El petróleo residual en todos los casos, fue recuperado mediante la extracción de hidrocarburos del medio utilizando CCl4 como solvente de extracción (tres extracciones sucesivas con 10 mL del sol-vente). Los extractos de hidrocarburos totales se analizaron cualitativamente por cromatografía gaseosa, en un equipo PU 4400 con detector iónico de llama y columna capilar de sílice fundida de 40mx0.25dm recubierta con SE 54. El gradiente de temperatura programado fue de 50 270oC a 6oC.min-1. 

== '''La biodegradación''' ==

La biodegradación es el proceso natural más importante para eliminar los hidrocarburos del petróleo presentes en el medio marino mediante la transformación de estos en oxígeno, dióxido de carbono y agua. Este proceso se lleva a cabo por microorganismos capaces de crecer y desarrollarse en el medio, usando dicha materia orgánica como sustrato y fuente de energía (6) (Bergueiro y Domínguez, 1996). La velocidad de degradación de las moléculas orgánicas por los microorganismos, bacterias en particular, depende de la configuración del sustrato, por lo cual, compuestos hidrocarbonados como el pristano y el fitano, son utilizados como trazadores biogeoquímicos en la identificación y curso de la biodegradación de crudos (7) (Rontani et al, 1986). Por esta razón, la disminución en los perfiles cromatográficos de los picos correspondientes a estos compuestos permite asegurar que la degradación es debida a la acción microbiana y no a otras causas. No se observan diferencias notables entre las diferentes variantes estudiadas por lo que podemos inferir que las células inmovilizadas no necesitan nutrientes para llevar a cabo la degradación del sustrato, aunque el medio se encuentre desbalanceado, utilizando éste por un meca-nismo de bioconversión. La variante D resulta más atractiva ya que no es necesario fertilizar la mancha, disminuyendo los cos-tos de aplicación y evitando la contaminación del ambiente marino, no sólo por la presencia de estos compuestos químicos, sino también por los productos metabólicos que se forman durante el crecimien-to celular y que pueden ser más dañinos que el petróleo. Una vez efectuada la recogida mecánica del crudo derramado, la biodegradación es el mecanismo más importante, efectivo y económico para la eliminación final de los hidrocarburos del petróleo presentes en el medio marino. Bajo su acción se ponen en juego múltiples reacciones de oxidación que conducen a la formación de hidrocarburos de menor peso molecular, además de la formación de dióxido de carbono, agua y biomasa microbiana. Este proceso se lleva a cabo por microorganismos capaces de crecer y desarrollarse en el medio, usando dicha materia orgánica como sustrato y fuente de energía. El petróleo Romashkino de 32 API está formado fundamentalmente por parafinas ligeras menores de C18, son degradadas fácilmente por los mecanismos de metil y -oxidación, dando generalmente CO2 y H2O (8) (Ramos et al, 1990). Por eso, este tipo de petróleo es muy susceptible a la degradación microbiana. El BIOIL, producto formado por un cultivo mixto, degrada todos los componentes del petróleo simul-táneamente y no de forma secuencial como cuando son atacados por un cultivo puro. Unos microor-ganismos degradan las fracciones parafínicas y otros el resto de los componentes según la afinidad por el sustrato y en dependencia del gasto energético, lo cual trae consigo que cada uno realice el proceso de biotransformación a diferentes velocidades. Esto depende en gran medida de la compe-tencia por el sustrato y de la velocidad de degradación de cada microorganismo. En la bibliografía, se refiere que la oxidación total de un sustrato de múltiples componentes como el petróleo requiere de la acción simultánea o sucesiva de varios microorganismos para lograr una mayor eficiencia en la degradación (9) (Van der Linden, 1978; Rambeloarisoa et al., 1984). (10) Joseph, I.N. en 1996 demostró que el porcentaje de hidrocarburos eliminado con un cultivo mixto es un orden superior que con un cultivo puro. En la proporción crudo - BIOIL (8:1), se evidencia que el producto, aún en ausencia de nutrientes no se inhibe por altas concentraciones de petróleo. (11) Omar et al. (1990) demostraron que con estas mismas concentraciones de crudo (8%) Candida parapsilosis inmovilizada degrada el 90% en sólo 3 semanas mientras que con células libres en el mismo período se degradó sólo un 27,5%. Todos los productos descritos en la bibliografía consultada emplean nutrientes para potenciar el proceso de degradación. Entre ellos tenemos el BIOTEMPOSCREEM, producto ruso liofilizado que contiene en su composición 14 especies de microorganismos hidrocarbonoclastas, nutrientes y un catalizador biológico biodegradable. (12) (Kaushansky, 1994), el PUTIDOIL, producto ruso liofilizado, formado por una cepa de Pseudomonas putida y nutrientes (13) (Bergueiro y cols., 1994, patente norteamericana No. 4.822.490) y un producto japonés que contiene nutrientes y microorganismos hidrocarbonoclastas inmovilizados en alginato de calcio (14) (Hideki, 1994).

 

== '''Bibliografía''' ==

 (4) Bellota, M.R. et al. (1994) ”Bioproducto para combatir la contaminación por hidrocarburos del petróleo y sus derivados” Certificado de autor de invención, País: Cuba No 22 323. (13) Bergueiro, J. R. et al. (1994). Bioproducto del crudo de petróleo Brent procedente del siniestro del "Ae-gean sea". III Congreso de Ciencias del Mar. Resúmenes: 193. (6) Bergueiro, J. R. y Domínguez, F., (1996): “Evaporación y mezclas de hidrocarburos”. Editorial Bilbilis. 348 p p. (14) Hideki, O. (1994). A new carrier for oil degrading bacteria. Programa and abstracts fourth international marine biotechnololgy conference, Tromso, Nonvay. (10) Joseph, I.N. (1996): “Microorganismos marinos degradadores de Hcs y sus aplicaciones en la industria petrolera”. Tesis para optar por el título de “Maestro en Ciencias Biológicas. 56 pp. (12) Kaushansky (1994). Comunicación personal. (1) Lee, K. and Levy, E.M. (1989): “Biodegradation of petroleum in the marine enviroment and its en-hancement”. Offprints from aquatic Toxicology and water quality management. Edited by Jerome A. Nriagy 217-243p (3) Lee, K. and Tremblay, G. H., (1995): “Biorremediation of oiled beach sediments. Assessment of inor-ganic and organic fertilizers, evolving technologics” Oil spill Conference: 107-112 p. (11) Omar, S.H.et al (1990): “Degradation of oily sludge from a flotation unit by free and inmovilized micro-organism”. Appl. Microbiol. Biotechnol. 34(2): 259-263p. Rambeloarisoa, E et al (1984): “Degradation of crude oil by mixed culture of bacteria isolated from foams“ Mar. Biol., 83: 69- 81p. (8) Ramos, I et al., (1990): Bioconversión de hidrocarburos petrolíferos presentes en agua de capa en ensa-yos pilotos”. Quimioindustria 90. Memorias, 32p. (7)Rontani, J.F. et al. (1986): “Gas chromatographic and gas chromatography/ mass spectrometry applied to the determination of to new pathway of pristane degradation by to marine mixed bacterial popula-tion”. Mar.Chem., 18: 9-16p. (9) Van der Linden, A. C. (1978) “Degradation of oil in the marine environment. In J. R. Watkinson (Ed), Developments in Biodegration of Hydrocarbons”, Elsevier Applied Science. 1: 165-200p. (5) Vela, G.R. and Ralston, (1978): “The effect of temperature on phenol degradation in waste water” Can. J. Microb. 24(11): 366-370p. (2) Wackett, L. P. and Ellis, L., (1998). “Bioremediation”. Microsoft. Encarta. Encyclopedia. Microsoft Corporation. All rights reserved.

Fonseca, E.L.; Núñez, R.R.; Villaverde, M.J; A. Núñez.

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BIOIL-FC

2010-04-27T18:36:37Z

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'''BIOIL-FC: Tecnología de Biorremediación de derrames de petróleo en ecosistemas marinos'''

El consumo de petróleo como fuente de energía ha conducido a un continuo aumento de la contaminación del entorno, especialmente del medio marino. En el mar, la biodegradación natural de los hidrocarburos del petróleo es un proceso muy lento y los daños alecosistema perduran por largos períodos de tiempo.

 BIOIL-FC resultó una tecnología efectiva para mitigar los daños ecológicos y económicos ocasionados por estos derrames de hidrocarburos, garantizando una rápida y adecuada recuperación del área impactada a un bajo costo  Los estudios de impacto ambiental de la aplicación del BIOIL-FC (no se presentan) realizados por POL-E-MAR INC (Canadá) y el aval del Centro de Información, Gestión y Educación Ambiental demuestran que esta tecnología no representa una contaminación secundaria para el medio ambiente, a diferencia de otros productos comerciales aplicados a nivel internacional.  Debido a la eficacia y bajos costos de producción de BIOIL-FC y que es la única tecnología nacional con que cuenta el país, esta incluido dentro del Plan Nacional de Contingencia contra Desastres por Derrames de Hidrocarburos del Estado Mayor Nacional de la Defensa Civil.  El diseño y construcción de un fermentador móvil constituye una innovación tecnológica en la producción de BIOIL-FC para nuestras condiciones, con el consiguiente ahorro de recursos.  Los resultados obtenidos nos han permitido poner a punto una novedosa tecnología, aplicable a cualquier tipo de derrame de hidrocarburos en latitudes tropicales, hecho sin precedentes en los países del área.

== '''¿Qué es BIOIL-FC?''' ==

 Es un producto diseñado para combatir la contaminación de petróleo en ambiente marino, el cual, esta compuesto por un cultivo mixto de bacterias marinas (A-5) y enriquecido con B. alcalophilus IDO-225. Es no tóxico y biodegradable

 

== '''Obtención de BIOIL-FC''' ==

 La obtención de las cantidades de BIOIL-FC necesarias para el tratamiento de derrames y el control de la calidad del bioproducto se realiza según la carta tecnológica propuesta por Núñez (2003). El proceso productivo se desarrolla en Plantas de Producción existentes en el país utilizando fermentadores de 800L y 25000L de volumen efectivo para las etapas de propagación y producción respectivamente. También se cuenta con una infraestructura para el trabajo biotecnológico en grupos multidisciplinarios que permite diseñar fermentadores con recursos existentes, para llevar a cabo trabajos de obtención del bioproducto a escala industrial. 

 

== '''Aplicación del BIOIL-FC''' ==

 El bioproducto se añadió luego de aplicarse técnicas de confinación y recuperación mecánica del petróleo, de forma parcial, aplicando cada templa de 10 000 ó 5000 L que se extraía según el caso. El producto fue asperjado a razón de 2L del bioproducto/m2 de área contaminada, teniendo en cuenta la componente horizontal de la corriente de marea. El bioproducto fue añadido desde la costa, en un camión cisterna con una bomba impulsora y desde una embarcación en el mar, aproximadamente a 150 metros de la costa. En el caso particular de la Ensenada de Arroyo Blanco no se aplicaron previamente técnicas de recuperación mecánica, por las características de la zona dañada.

 

== '''Evolución de los microorganismos degradadores ''' ==

 Los niveles de microorganismos antes y después del tratamiento con BIOIL-FC de los derrames ocurridos en la Bahía de Cienfuegos, Bahía de Matanzas, playa Arroyo Bermejo y ensenada de Arroyo Blanco, evidencian un incremento notable de los niveles de microorganismos degradadores de hidrocarburos en cada tratamiento para las estaciones evaluadas.

El análisis cualitativo de los hidrocarburos por cromatografía gaseosa demostró la presencia de compuestos petrógenicos contaminates y tóxicos antes del tratamiento con el BIOIL-FC, aún cuando en dos de los ecosistemas la contaminación persistía después de más de un mes de vertido. Los muestreos realizados una vez aplicado el BIOIL-FC evidenciaron una drástica disminución de las normales parafinas y la reducción del área de la mezcla de compuestos no resueltos (UCM), lo que evidencia la degradación en las fracciones aromáticas, resinas y asfaltenos, en las estaciones de cada uno de los tratamientos realizados.

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Bacterias del género Bacillus

2010-04-27T16:39:39Z

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'''Bacterias del género Bacillus degradadoras de n-hexadecano aisladas del sedimento marino: Parámetros cinéticos'''

La contaminación del ambiente marino por hidrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El bioproducto BIOIL-FC, diseñado para combatir los derrames de petróleo, está formado por bacterias degradadoras de hidrocarburos, tales como Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60. El presente trabajo está dirigido a determinar y comparar los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60 en n-hexadecano mediante el conteo en cámara de Neubauer y el método de Lineweaver-Burk, así como definir los nuevos modelos de inhibición del crecimiento.

El  Bacillus licheniformis cepa CBM-60 degrada el n-hexadecano a mayor velocidad que el Bacillus alcalophilus cepa CBM-225, no reflejando inhibición de su crecimiento en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, la composición bacteriana del bioproducto BIOIL-FC puede ser enriquecida con una mayor proporción de la cepa CBM-60 para combatir derrames de petróleo con altas concentraciones en n-hexadecano. 

== '''La contaminación ambiental por hidrocarburo''' ==

La contaminación ambiental por hidrocarburos del petróleo y en particular del ambiente marino, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El océano constituye un ecosistema muy dinámico y complejo, que el hombre está destruyendo con contaminantes químicos, entre ellos el petróleo y sus derivados, llegando a comprometer la trama alimentaria del medio marino. La posición geográfica de nuestro archipiélago y el tráfico marítimo en torno al mismo, así como la creciente explotación y perforación de pozos de petróleo en nuestra plataforma, aumentan considerablemente la posible contaminación de las costas.

Desde finales de la década del 80 del siglo pasado, el departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) perteneciente al Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente, ha trabajado en el aislamiento y conservación de bacterias aisladas de ecosistemas marinos capaces de degradar petróleo (1) (Joseph et al., 1994; Núñez, 2003; Ortiz, 2004), las cuales forman parte de la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del centro en la actualidad A partir de una selección de estas cepas se formuló el bioproducto BIOIL-FC. La efectividad de este bioproducto se ha comprobado durante los tratamientos de derrames de petróleo ocurridos en las Bahía de Cienfuegos y de Matanzas, en el recalo accidental de petróleo que contaminó la Playa Arroyo Bermejo en Jibacoa y en la Ensenada de Arroyo Blanco en Holguín (2) (Núñez, 2003) con resultados satisfactorios. 

== '''Bioil- Fc''' ==

 El BIOIL-FC está formado por cinco bacterias degradadoras de hidrocarburos, Dentro de éstas se encuentran Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 como las más importantes y las escogidas para desarrollar el siguiente estudio.

== '''Microorganismos empleados''' ==

 El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 (3) (Núñez, 2003) y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 (4) (Ortiz et al., 2002) aislados de los sedimentos de la Bahía de Cárdenas, Matanzas y pertenecientes a la CBM del CEBIMAR. 

== '''Medios de Cultivo''' ==

 Para la conservación de las cepas CBM-225 y cepa CBM-60 se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según (5) Gorbienko (1961), la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana de la cepa CBM-225 se realizó según(6) Núñez (2003) y para la cepa CBM-60 se llevó a cabo según (7) Ortiz (2004). Los estudios cinéticos del crecimiento se desarrollaron en el medio de degradación de hidrocarburos propuesto por (8) Núñez (2003), estos medios contenían concentraciones de n-hexadecano (Merck-Schuchardt, 99 % de pureza) de 5, 10, 20, 30, 40 y 60 g. L-1, 

== '''Condiciones de cultivo en zaranda''' ==

 Todos los experimentos desarrollados a escala de zaranda fueron realizados a partir de cultivos de 24 horas en cuñas de medio # 6 agarizado (9)(Gorvienko, 1961). Con este cultivo se obtuvo el preinóculo en el medio de obtención de biomasa(10) (Núñez, 2003; Ortiz, 2004). Luego de 24 horas, el cultivo fue inoculado a una concentración inicial de 106 celmL-1 en los medios de degradación (11) (Núñez, 2003), de los cuales fueron tomadas muestras cada cuatro horas. Todos los experimentos fueron desarrollados a escala de zaranda orbital rotatoria Infors a 125 r.min-1 y 30 ºC. Los medios de cultivo fueron esterilizados a 121 oC por 15 minutos y fue utilizado como control un medio de cultivo estéril en las mismas condiciones. 

== '''Crecimiento microbiano en medio de degradación de hidrocarburos''' ==

 La determinación del crecimiento microbiano en el medio de degradación de hidrocarburos se realizó mediante el conteo total de células en cámara de Neubauer (12) (Martínez et al., 1989). Velocidad específica de crecimiento (µ) La µ fue determinada en la fase exponencial del crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido(13) (López y Gódia, 1998). Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60

Para cada una de las concentraciones de sustrato fue calculada en la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60. A partir de ellas fueron estimados los valores de velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y de la constante de disociación o constante de afinidad (Ks) mediante la transformación lineal de Lineweaver-Burk (14)(Chávez et al., 1990). Además, fue determinada la constante de inhibición (Ki) de ambas cepas con n-hexadecano según la expresión de Andrews linealizada (15) (Chávez et al., 1909; Boyer, 1999). 

 

== '''Determinación del modelo cinético de las cepas CBM-225 y CBM-60''' ==

 La determinación de los nuevos modelos cinéticos y los valores de Ki en la zona de inhibición del crecimiento de ambas cepas se realizó mediante la ecuación modificada de Andrews según (16) Cabranes, 2005.

== '''Referencias''' ==

 (15)Boyer, R. (1999): Concepts in Biochemistry. Ed: Keith Dodson. Chapter 4. Amino acids, peptides, and proteins. pp78-110, Chapter 6. Enzymes as biological catalysts. 142-170pp and Chapter 15. Metabolism of carbohydrates. pp:445-483. Copyright © by Brooks/Cole Publishing Company. USA. (16)Cabranes Y. C. (2005). Cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo por Bacillus alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de maestría. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:28-49. (14)Chavez, P. M.; Díaz, D. J.; Pérez, L. V.; Delfín, G. J. (1990):Temas de Enzimología. Tomo I. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:51-87.. (6,9)Gorvienko, Y. A. (1961): Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos. Mikrobiol. 30(1) 168-172. (1) Joseph, N.; Capó, M. C.; Bellota, M.; Ramos, Y.; Fuentes, M. (1994): Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana. Revista Ciencias Biológicas. Microbiología. 27:137-148.. (13) López, J.; Gódia C. F. (1998): Ingeniería Bioquímica. 1ra Edición. Ed. SINTESIS, S.A. pp: 9-45. (12)Martínez, J.; Sánchez, A. I.; Quintana, M.; Pazos, V.; Del Barrio, G. (1989): “Microbiología General”. Editorial Pueblo y Educación. 3: 31-101. (2,3,6,8,10,11)Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89. (4)Ortiz, E.; Morales, M.; Graña, L.; Enríquez, D.; Núñez, R.; Núñez, L.; Coya, S.; : Colección de microorganismos marinos del Instituto de Oceanología. Informe Final del Proyecto de investigación. Presentado ante el Comité de Expertos del Programa “Sistemática y Colecciones Biológicas, su Conservación, Mantenimiento y Exhibición”, Agencia de Medio Ambiente. pp: 6-19. (7)Ortiz, E. (2004): Obtención de un tensioactivo a partir de una bacteria marina para la biorremediación de la contaminación con hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp:15-62. 

Yoania Cabranes Campos 

Centro de Bioproductos Marinos           httpwww.medioambiente.cu 

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Bacterias marinas de Cuba

2010-04-27T15:55:06Z

MiguelAngel cebimar:

'''Actividades desarrolladas en la colección de bacterias marinas''' 

En la Colección de Bacterias Marinas se conservan aislamientos procedentes de diferentes regiones del archipiélago cubano. Aquí se desarrollan actividades de investigación y servicios, entre las primeras se encuentran los estudios para la conservación de las cepas a mediano y largo plazo, la determinación taxonómica de sus componentes, la evaluación de bioactividades con aplicación en la industria médico-farmacéutica y en el saneamiento ambiental y la actualización de la base de datos asociada. Entre las actividades de servicios se encuentran el mantenimiento y caracterización de las cepas, así como el suministro a los usuarios.

Las colecciones de cultivos microbianos son consideradas como centros de recursos biológicos (bancos de germoplasma) y constituyen fuentes para las investigaciones biotecnológicas y el desarrollo. Entre sus funciones principales se encuentran el depósito, la conservación y distribución de cultivos que se-rán empleados con fines docentes, industriales o investigativos. La adecuación de las buenas prácticas de laboratorio a las condiciones de trabajo propias de cada colección microbiana permitirá la manten-ción de la pureza, viabilidad y estabilidad genética de los cultivos que custodian(10)

La Colección de Bacterias Marinas (CBM) forma parte del Departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR), Agencia de Medio Ambiente, CITMA, fue consti-tuida desde 1989 y se encuentra conformada por casi 400 cultivos de bacterias heterótrofas aislados a partir de diferentes estratos en zonas costeras y oceánicas pertenecientes al archipiélago cubano.

== '''Conservación de las cepas''' ==

 

Teniendo en cuenta el comportamiento promedio del recobrado de las ce-pas estudiadas, los mejores métodos fueron la mantención en agar nutriente cubierto con aceite mineral (mediano plazo) y la liofilización (largo plazo), debido a que en ambos casos fueron recuperadas todas las cepas estudiadas con concentraciones aceptables y a que se mantuvieron las propiedades biológicas de las mismas. En nuestra colección la mayoría de las cepas se encuentran conservadas en cuñas de agar cubiertas por aceite mineral, paulatinamente, de acuerdo a las potencialidades que presentan y a las posibilidades ma-teriales, son liofilizadas, con lo que se incrementa el banco maestro que se mantiene en refrigeración y cuya calidad es chequeada anualmente. De éste modo logramos la conservación a mediano y largo plazo de las cepas tal y como se orienta en la Guía para el establecimiento y funcionamiento de las colecciones microbianas (3). 

== Clasificación taxonómica ==

La determinación taxonómica de los cultivos integrantes de la colección se realizó a través de varios métodos (microscopía, pruebas bioquímicas convencionales y sistema API 20 NE), encontrándose que el 55% de los cultivos en custodia no cuenta con taxonomía definida, mientras que el 45 % sí, entre los que el 29% fue clasificado hasta el nivel de género y el 16 % hasta el nivel de especie. De acuerdo a lo anteriormente planteado, en nuestra colección se encuentran representados los siguien-tes géneros: Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Chryseomonas, Coryne-bacterium, Halorubrum, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Proteus, Stenotrophomonas y Vi-brio, mientras que entre las especies se encuentran: Alcaligenes aquamarinus, Bacillus brevis, Chry-seomonas luteola, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Vibrio splendidus, todas provenientes de las aguas territoriales cubanas. 

== Bioactividades ==

 

La CBM es una colección de interés biotecnológico, debido a las potencialidades y aplicación de las cepas que custodia, por lo que la determinación de bioactividades en éstas es una práctica común en nuestro laboratorio.

Actividad antimicrobiana: La importancia de esta bioactividad radica en la resistencia que han des-arrollado algunos microorganismos al empleo de los antibióticos comerciales. Cuando los cultivos fue-ron enfrentados a las cepas indicadoras establecidas (patógenos humanos), se encontró que el 44 % de las cepas en la colección presentó dicha potencialidad. Lo mismo ocurrió respecto a bacterias patóge-nas de peces y a los hongos fitopatógenos. Los resultados muestran que la CBM es una fuente de culti-vos con dicha capacidad (8). Actividad proteolítica: El empleo de las enzimas proteolíticas de origen animal fue sustituido a causa de su inestabilidad por las de origen microbiano, éstos proliferan en medios con bajo costo y excretan una gran diversidad de enzimas capaces de catalizar una o diversas reacciones, lo que posibilita la elección de las condiciones para su producción. Entre ellos se encuentran los actinomicetos de origen marino como fuente de una nueva generación de bioactivos de aplicación en la industria médico farma-céutica (4). El enfrentamiento de las cepas al medio agar leche para la determinación de la actividad proteolítica mostró que el 35 % de las cepas en colección presentó la actividad caseinasa (proteolítica), la que encuentra aplicación en la lisis de proteínas de origen animal y vegetal, en la preparación de quesos, en la fabricación de la salsa de soya, así como en la obtención de pan y galletas hojaldradas. Actividad hemolítica: Esta actividad constituye un método para la detección de microorganismos po-tencialmente productores de tensioactivos, ya que dichos compuestos presentan la propiedad de lisar los glóbulos rojos. De éste modo se logra una rápida detección de cepas con actividad superficial (24 h), en comparación con los tamizajes basados en vías fermentativas, que requieren de largos períodos de incubación. En éste caso el 43 % de nuestras cepas presentó dicha actividad, sugiriéndose que luego de estudios posteriores algunos de los cultivos pudieran emplearse como indicadores adicionales para la presencia de hemólisis. Excreción de tensioactivos: El interés por la búsqueda y obtención de tensioactivos de origen biológico se ha incrementado notablemente debido a las múltiples aplicaciones que éstos presentan para la industria como detergentes, emulgentes, humectantes e inhibidores de corrosión, entre otras (1). A través del culti-vo en medio líquido con sustratos hidrosolubles en agitación, se determinó que el 25 % de las cepas en colección fue capaz de excretar moléculas con actividad tensioactiva. La síntesis exocelular de estos com-puestos permite conocer su actividad superficial por un método directo, rápido y sencillo como la deter-minación de las tensiones superficial e interfacial. A pesar de que el mecanismo fisiológico para la producción de biotensioactivos a partir de sustratos hidrosolubles no ha sido totalmente esclarecido, se conoce una gran variedad de microorganismos pro-ductores en presencia de dichas fuentes, las que han sido utilizadas frecuentemente por la simplicidad del proceso fermentativo y su fácil comercialización. 

== Degradación de compuestos: ==

 Habitualmente los microorganismos para su nutrición emplean el carbono contenido en los carbohidra-tos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y alcoholes monohídricos. Sin embargo, al encontrarse sometidos a presiones que comprometen la supervivencia, son capaces de activar vías para lograr los nutrientes necesarios, tal es el caso de la degradación de hidrocarburos y compuestos organoclorados en que se plantea que el mecanismo ocurre a través enzimas controladas a nivel genómico. Tales moléculas com-plejas son degradadas por ciertas bacterias en otras más simples, que serán a su vez desdobladas por otras sucesivamente hasta su completa descomposición, con la finalidad de utilizar el carbono para su crecimiento y multiplicación (2). Hidrocarburos: La búsqueda de productos, que faciliten la eliminación de los hidrocarburos vertidos al medio ambiente se ha intensificado en los últimos años, en particular, las aguas de consumo requie-ren especial atención por las implicaciones para la salud y otras esferas. El enfrentamiento de nuestras cepas a un medio que contiene hidrocarburos como única fuente de carbono mostró que el 30 % de las bacterias en la colección fue capaz de degradar éstos compuestos. Tales resultados evidencian las po-tencialidades de las cepas de la colección en el desarrollo de bioproductos para el tratamiento de dife-rentes sistemas expuestos a contaminación por hidrocarburos (2). Organoclorados: Entre los compuestos considerados como xenobióticos se incluyen: benceno, tolueno, estireno, compuestos halogenados como el pentaclorofenol y bifenilos policlorados, cuya concentración varía en las aguas de desecho, son altamente tóxicos a las diferentes formas de vida y difíciles de de-gradar (9). El crecimiento o la ausencia de éste en el medio de cultivo suplementado nos permitió de-terminar que el 14 % de los cultivos pertenecientes a la colección fueron agresivos frente al clorofenol y/o pentaclorofenol. Se plantea que ambos compuestos pueden ser atacados por bacterias y hongos me-diante el mecanismo explicado anteriormente (cometabolismo) ó utilizando tales compuestos como única fuente de carbono para su crecimiento con liberación de cloro, dióxido de carbono y formación de catecoles o quinonas, sin conocerse exactamente las enzimas participantes en el proceso. Tales re-sultados nos ofrecen la posibilidad de abordar también la biorremediación de dichos contaminantes. Adicionalmente, en la etapa, se inició un tamizaje para la determinación de cuáles cepas son capaces de excretar metabolitos con efecto antiinflamatorio, con resultados alentadores. Base de datos de la colección: La base de datos asociada a la colección facilita la interpretación del valor como recurso genético con que contamos, puesto que contiene los datos referidos a cada una de las cepas como son: la persona que realizó el aislamiento, el área geográfica de donde fue tomada, el estrato de procedencia, la designación taxonómica y las actividades biológicas, información con la que el usuario puede interactuar. . 

== '''Bibliografia''' ==

 1. Banat, I., Makkar, R., y Cameotra, S. Potential Commercial Applications of Microbial Surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 495-508, 2000. 2. Cabranes, Y. Cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo por Bacillus alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de Maestría, Fac. Biología, U.H., 2005. 3. Guidelines for the Establishment and Operation of Collections of Cultures of Microorganisms. Re-vised by the WFCC Executive Board - WFCC Standards Committee, World Federation for Culture Collections - UNESCO, 2nd Edition, Copyright June 1999 ISBN 92 9109 043 3. 4. Mincer, T.J., P.R. Jensen, C.A. Kauffman and W. Fenical. Widespread and Persistent Populations of Major New Marine Actinomycete Taxon in Ocean Sediments. Applied and Environmental Mi-crobiology 68(10): 5005-5011, 2002. 5. Morales, M., E. Ortiz y L. Graña. Levantamiento de la Colección de Bacterias Marinas. Informe interno, Departamento de Microbiología Aplicada, Instituto de Oceanología, 2001. 6. Morales, M., E. Ortiz, D. Enríquez, M. Villaverde, V. Caballero, R. Núñez, A. Miranda, E. Fonse-ca, Y. Díaz, Y. Delgado, R. Pizarro, C. Martínez, E. Iglesias, C. del Puerto, M. Llanio, M. Fernán-dez, B. Cabrera, E. Amat y S. Fundora. Informe Final del Proyecto "Conservación y Evaluación de Microorganismos Marinos en Colección" presentado ante Comité de Expertos, AMA, CITMA, 2005. 7. Reglas generales de gestión y organización para procedimientos de conservación de cepas. AE-NOR- EN 1619, Diciembre, 1996. 8. Reyes,Y. Selección de cepas bacterianas productoras de antimicrobianos. Trabajo de Curso, IPQI "Mártires de Girón", 2003. 9. Rivero, A. Selección de bacterias aisladas de ecosistemas marinos con capacidad para degradar fe-noles. Trabajo de Diploma, Fac. Biología, U.H. 2005. 10. Smith, D. The OECD Biological Resource Centres Initiative: Accreditation for Culture Collec-tions. Newsletter UKFCC 32: 2-3, 2003.

Morales, Margarita, Eudalys Ortiz, Mario Villaverde, Valia Caballero, Alina Miranda

Centro de Bioproductos Marinos  http//www.medioambiente.cu 

 

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Bacterias marinas de Cuba

2010-04-27T15:53:11Z

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'''Actividades desarrolladas en la colección de bacterias marinas''' 

En la Colección de Bacterias Marinas se conservan aislamientos procedentes de diferentes regiones del archipiélago cubano. Aquí se desarrollan actividades de investigación y servicios, entre las primeras se encuentran los estudios para la conservación de las cepas a mediano y largo plazo, la determinación taxonómica de sus componentes, la evaluación de bioactividades con aplicación en la industria médico-farmacéutica y en el saneamiento ambiental y la actualización de la base de datos asociada. Entre las actividades de servicios se encuentran el mantenimiento y caracterización de las cepas, así como el suministro a los usuarios.

Las colecciones de cultivos microbianos son consideradas como centros de recursos biológicos (bancos de germoplasma) y constituyen fuentes para las investigaciones biotecnológicas y el desarrollo. Entre sus funciones principales se encuentran el depósito, la conservación y distribución de cultivos que se-rán empleados con fines docentes, industriales o investigativos. La adecuación de las buenas prácticas de laboratorio a las condiciones de trabajo propias de cada colección microbiana permitirá la manten-ción de la pureza, viabilidad y estabilidad genética de los cultivos que custodian(10)

La Colección de Bacterias Marinas (CBM) forma parte del Departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR), Agencia de Medio Ambiente, CITMA, fue consti-tuida desde 1989 y se encuentra conformada por casi 400 cultivos de bacterias heterótrofas aislados a partir de diferentes estratos en zonas costeras y oceánicas pertenecientes al archipiélago cubano.

== '''Conservación de las cepas''' ==

 

Teniendo en cuenta el comportamiento promedio del recobrado de las ce-pas estudiadas, los mejores métodos fueron la mantención en agar nutriente cubierto con aceite mineral (mediano plazo) y la liofilización (largo plazo), debido a que en ambos casos fueron recuperadas todas las cepas estudiadas con concentraciones aceptables y a que se mantuvieron las propiedades biológicas de las mismas. En nuestra colección la mayoría de las cepas se encuentran conservadas en cuñas de agar cubiertas por aceite mineral, paulatinamente, de acuerdo a las potencialidades que presentan y a las posibilidades ma-teriales, son liofilizadas, con lo que se incrementa el banco maestro que se mantiene en refrigeración y cuya calidad es chequeada anualmente. De éste modo logramos la conservación a mediano y largo plazo de las cepas tal y como se orienta en la Guía para el establecimiento y funcionamiento de las colecciones microbianas (3). 

== Clasificación taxonómica ==

La determinación taxonómica de los cultivos integrantes de la colección se realizó a través de varios métodos (microscopía, pruebas bioquímicas convencionales y sistema API 20 NE), encontrándose que el 55% de los cultivos en custodia no cuenta con taxonomía definida, mientras que el 45 % sí, entre los que el 29% fue clasificado hasta el nivel de género y el 16 % hasta el nivel de especie. De acuerdo a lo anteriormente planteado, en nuestra colección se encuentran representados los siguien-tes géneros: Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Chryseomonas, Coryne-bacterium, Halorubrum, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Proteus, Stenotrophomonas y Vi-brio, mientras que entre las especies se encuentran: Alcaligenes aquamarinus, Bacillus brevis, Chry-seomonas luteola, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Vibrio splendidus, todas provenientes de las aguas territoriales cubanas. 

== Bioactividades ==

 

La CBM es una colección de interés biotecnológico, debido a las potencialidades y aplicación de las cepas que custodia, por lo que la determinación de bioactividades en éstas es una práctica común en nuestro laboratorio.

Actividad antimicrobiana: La importancia de esta bioactividad radica en la resistencia que han des-arrollado algunos microorganismos al empleo de los antibióticos comerciales. Cuando los cultivos fue-ron enfrentados a las cepas indicadoras establecidas (patógenos humanos), se encontró que el 44 % de las cepas en la colección presentó dicha potencialidad. Lo mismo ocurrió respecto a bacterias patóge-nas de peces y a los hongos fitopatógenos. Los resultados muestran que la CBM es una fuente de culti-vos con dicha capacidad (8). Actividad proteolítica: El empleo de las enzimas proteolíticas de origen animal fue sustituido a causa de su inestabilidad por las de origen microbiano, éstos proliferan en medios con bajo costo y excretan una gran diversidad de enzimas capaces de catalizar una o diversas reacciones, lo que posibilita la elección de las condiciones para su producción. Entre ellos se encuentran los actinomicetos de origen marino como fuente de una nueva generación de bioactivos de aplicación en la industria médico farma-céutica (4). El enfrentamiento de las cepas al medio agar leche para la determinación de la actividad proteolítica mostró que el 35 % de las cepas en colección presentó la actividad caseinasa (proteolítica), la que encuentra aplicación en la lisis de proteínas de origen animal y vegetal, en la preparación de quesos, en la fabricación de la salsa de soya, así como en la obtención de pan y galletas hojaldradas. Actividad hemolítica: Esta actividad constituye un método para la detección de microorganismos po-tencialmente productores de tensioactivos, ya que dichos compuestos presentan la propiedad de lisar los glóbulos rojos. De éste modo se logra una rápida detección de cepas con actividad superficial (24 h), en comparación con los tamizajes basados en vías fermentativas, que requieren de largos períodos de incubación. En éste caso el 43 % de nuestras cepas presentó dicha actividad, sugiriéndose que luego de estudios posteriores algunos de los cultivos pudieran emplearse como indicadores adicionales para la presencia de hemólisis. Excreción de tensioactivos: El interés por la búsqueda y obtención de tensioactivos de origen biológico se ha incrementado notablemente debido a las múltiples aplicaciones que éstos presentan para la industria como detergentes, emulgentes, humectantes e inhibidores de corrosión, entre otras (1). A través del culti-vo en medio líquido con sustratos hidrosolubles en agitación, se determinó que el 25 % de las cepas en colección fue capaz de excretar moléculas con actividad tensioactiva. La síntesis exocelular de estos com-puestos permite conocer su actividad superficial por un método directo, rápido y sencillo como la deter-minación de las tensiones superficial e interfacial. A pesar de que el mecanismo fisiológico para la producción de biotensioactivos a partir de sustratos hidrosolubles no ha sido totalmente esclarecido, se conoce una gran variedad de microorganismos pro-ductores en presencia de dichas fuentes, las que han sido utilizadas frecuentemente por la simplicidad del proceso fermentativo y su fácil comercialización. 

== Degradación de compuestos: ==

 Habitualmente los microorganismos para su nutrición emplean el carbono contenido en los carbohidra-tos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y alcoholes monohídricos. Sin embargo, al encontrarse sometidos a presiones que comprometen la supervivencia, son capaces de activar vías para lograr los nutrientes necesarios, tal es el caso de la degradación de hidrocarburos y compuestos organoclorados en que se plantea que el mecanismo ocurre a través enzimas controladas a nivel genómico. Tales moléculas com-plejas son degradadas por ciertas bacterias en otras más simples, que serán a su vez desdobladas por otras sucesivamente hasta su completa descomposición, con la finalidad de utilizar el carbono para su crecimiento y multiplicación (2). Hidrocarburos: La búsqueda de productos, que faciliten la eliminación de los hidrocarburos vertidos al medio ambiente se ha intensificado en los últimos años, en particular, las aguas de consumo requie-ren especial atención por las implicaciones para la salud y otras esferas. El enfrentamiento de nuestras cepas a un medio que contiene hidrocarburos como única fuente de carbono mostró que el 30 % de las bacterias en la colección fue capaz de degradar éstos compuestos. Tales resultados evidencian las po-tencialidades de las cepas de la colección en el desarrollo de bioproductos para el tratamiento de dife-rentes sistemas expuestos a contaminación por hidrocarburos (2). Organoclorados: Entre los compuestos considerados como xenobióticos se incluyen: benceno, tolueno, estireno, compuestos halogenados como el pentaclorofenol y bifenilos policlorados, cuya concentración varía en las aguas de desecho, son altamente tóxicos a las diferentes formas de vida y difíciles de de-gradar (9). El crecimiento o la ausencia de éste en el medio de cultivo suplementado nos permitió de-terminar que el 14 % de los cultivos pertenecientes a la colección fueron agresivos frente al clorofenol y/o pentaclorofenol. Se plantea que ambos compuestos pueden ser atacados por bacterias y hongos me-diante el mecanismo explicado anteriormente (cometabolismo) ó utilizando tales compuestos como única fuente de carbono para su crecimiento con liberación de cloro, dióxido de carbono y formación de catecoles o quinonas, sin conocerse exactamente las enzimas participantes en el proceso. Tales re-sultados nos ofrecen la posibilidad de abordar también la biorremediación de dichos contaminantes. Adicionalmente, en la etapa, se inició un tamizaje para la determinación de cuáles cepas son capaces de excretar metabolitos con efecto antiinflamatorio, con resultados alentadores. Base de datos de la colección: La base de datos asociada a la colección facilita la interpretación del valor como recurso genético con que contamos, puesto que contiene los datos referidos a cada una de las cepas como son: la persona que realizó el aislamiento, el área geográfica de donde fue tomada, el estrato de procedencia, la designación taxonómica y las actividades biológicas, información con la que el usuario puede interactuar. . 

BIBLIOGRAFIA 1. Banat, I., Makkar, R., y Cameotra, S. Potential Commercial Applications of Microbial Surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 495-508, 2000. 2. Cabranes, Y. Cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo por Bacillus alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de Maestría, Fac. Biología, U.H., 2005. 3. Guidelines for the Establishment and Operation of Collections of Cultures of Microorganisms. Re-vised by the WFCC Executive Board - WFCC Standards Committee, World Federation for Culture Collections - UNESCO, 2nd Edition, Copyright June 1999 ISBN 92 9109 043 3. 4. Mincer, T.J., P.R. Jensen, C.A. Kauffman and W. Fenical. Widespread and Persistent Populations of Major New Marine Actinomycete Taxon in Ocean Sediments. Applied and Environmental Mi-crobiology 68(10): 5005-5011, 2002. 5. Morales, M., E. Ortiz y L. Graña. Levantamiento de la Colección de Bacterias Marinas. Informe interno, Departamento de Microbiología Aplicada, Instituto de Oceanología, 2001. 6. Morales, M., E. Ortiz, D. Enríquez, M. Villaverde, V. Caballero, R. Núñez, A. Miranda, E. Fonse-ca, Y. Díaz, Y. Delgado, R. Pizarro, C. Martínez, E. Iglesias, C. del Puerto, M. Llanio, M. Fernán-dez, B. Cabrera, E. Amat y S. Fundora. Informe Final del Proyecto "Conservación y Evaluación de Microorganismos Marinos en Colección" presentado ante Comité de Expertos, AMA, CITMA, 2005. 7. Reglas generales de gestión y organización para procedimientos de conservación de cepas. AE-NOR- EN 1619, Diciembre, 1996. 8. Reyes,Y. Selección de cepas bacterianas productoras de antimicrobianos. Trabajo de Curso, IPQI "Mártires de Girón", 2003. 9. Rivero, A. Selección de bacterias aisladas de ecosistemas marinos con capacidad para degradar fe-noles. Trabajo de Diploma, Fac. Biología, U.H. 2005. 10. Smith, D. The OECD Biological Resource Centres Initiative: Accreditation for Culture Collec-tions. Newsletter UKFCC 32: 2-3, 2003.

Morales, Margarita, Eudalys Ortiz, Mario Villaverde, Valia Caballero, Alina Miranda

Centro de Bioproductos Marinos  http//www.medioambiente.cu 

 

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Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos

2010-04-07T13:51:44Z

MiguelAngel cebimar:

{{Desarrollo}}
{{Ecosistema|nombre=|imagen=|ecozona=|clima=|tipo de vegetacion=|latitudes=|superficie=|continente(s)=|imagen2=}}

'''Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos'''. En la actualidad los suelos contaminados con hidrocarburos representan el 70% del total de los ecosistemas impactados. A partir del aislamiento, selección y conservación de bacterias marinas degradadoras de hidrocarburos y productoras de sustancias tensioactivas se formuló un producto denominado BIOIL-FC. Este producto ha sido aplicado satisfactoriamente en derrames de hidrocarburos en el mar.

La biorremediación por bioestimulación de suelo contaminado con hidrocarburos empleando el producto BIOIL-FC es superior a la técnica de bioestimulación tradicional con nutrientes, lo cual evidencian las potencialidades de este bioproducto para el saneamiento de ambientes terrestres impactados con petróleo y sus derivados.

== La Contaminación con hidrocarburos ==

La contaminación con hidrocarburos en diferentes ecosistemas se ha incrementado en los últimos años debido al aumento en la actividad de exploración y producción de la Industria Petrolera. En la actualidad los suelos contaminados con estos compuestos representan el 70 % del total de los ecosistemas impactados. <ref>(Swannell, 2000).</ref>

Los derrames de petróleo y sus derivados son considerados de gran impacto al ambiente por los nefastos daños que ocasionan en los ecosistemas impactados. Las investigaciones rela-cionadas con la biorremediación como alternativa eficiente para la recuperación de los mis-mos cobran cada vez mayor importancia.

== La bioorremediación ==

La biorremediación está basada en la capacidad que tienen los microorganismos de crecer a partir de la utilización de sustancias recalcitrantes al medio ambiente <ref>(Shmaefsky, 1999, Mack Kay, 2001)</ref> . Algunos de ellos son capaces de degradar estos compuestos hasta dióxi-do de carbono, sales, agua y otros productos inocuos al medio ambiente <ref>(Advanced Bio-Tech, 2000)</ref>  los cuales se integran posteriormente a los ciclos biogeoquímicos naturales <ref>(Mack Kay, 2001)</ref> . Esta técnica permite tratar grandes volúmenes de contaminantes con un impacto ambiental mínimo, a diferencia de otros procedimientos de descontaminación <ref>(Molnaa y Grubbs, 2001)</ref>.

La biorremediación puede ser aplicada “in situ” o “ex situ”. Las tecnologías “in situ” se refie-ren a las que se aplican en el área a tratar, mientras que en las “ex situ” los productos son aplicados al material contaminado donde pueda ser tratado <ref>(Gruiz y Kriston, 1995; Shmaefsky, 1999; Tuttle y Lester, 2001).</ref>. 

Los procesos de biorremediación clasifican en técnicas de bioestimulación y bioaumentación. La técnica de bioestimulación se basa en el uso de nutrientes, sustratos o aditivos con activi-dad superficial para estimular el crecimiento y desarrollo de organismos capaces de biode-gradar compuestos contaminantes del medio ambiente <ref>(Gruiz y Kriston, 1995; Baheri y Meysami, 2002; Núñez, 2003).</ref>). 

Las técnicas de bioaumentación describe la adición de organismos o enzimas a un material con el propósito de eliminar sustancias indeseables <ref>(Shmaefsky, 1999)</ref> . La bioaumenta-ción asegura que estén presentes los microorganismos específicos capaces de degradar al compuesto contaminante no deseado hasta sus moléculas básicas <ref>(Advanced BioTech, 2000)</ref>. Las bacterias son los microorganismos más comúnmente utilizados para la bioaumen-tación <ref>(Shmaefsky, 1999; Saponaro et al, 2002).</ref>. 

A partir de un programa de aislamiento, selección y conservación de bacterias marinas hidro-carbonoclastas y productoras de sustancias tensioactivas se han formulados diferentes bio-productos para su aplicación en derrames de hidrocarburos, teniendo en cuenta que la ex-tensión y diversidad taxonómica de los microorganismos marinos representan un potencial para obtener productos naturales bioactivos que garanticen la conservación del medio am-biente.

El cultivo mixto A-5, compuesto por bacterias marinas hidrocarbonoclastas forma parte del bioproducto BIOIL-FC <ref>(Núñez, 2003 y Núñez et al, 2003).</ref>. Este bioproducto presenta una alta capacidad de oxidación del petróleo y sus derivados como resultado de la actividad metabólica de las cepas que lo integran.

== Materiales y Métodos ==

Se diseñó un experimento con tres bloques, donde se evaluaron las técnicas de bioestimula-ción y bioaumentación con el producto BIOIL-FC, el cual está formado por bacterias degra-dadoras de hidrocarburos aisladas de la plataforma cubana y que forman parte de la colec-ción de bacterias marinas del Centro de Bioproductos Marinos.

Los estudios fueron realizados en parcelas (41 cm de largo x 30 cm de ancho x 2,5 cm de profundidad) de 3 Kg de suelos contaminados con un 10 % de fuel oil o gasolina regular (85 % o 96% de octanaje). Las parcelas fueron aereadas semanalmente y la humedad fue con-trolada a un 20 %, además se añadió inicialmente 6 % (w/w) de (NH4)2HPO4. Se tomaron muestras integradas de las parcelas cada 7 días para las determinaciones de concentración de bacterias heterótrofas, biodegradadores de petróleo, índice de respirometría y concentra-ción hidrocarburos totales.

'''Concentración de hetrótrofos totales presentes en el suelo '''(ISO 4833: 1991 e ISO 6837: 1993): A partir de muestras de suelo se realizaron diluciones seriadas, las cuales fueron inoculadas a razón de 100µL en placas, que fueron incubadas a 30oC durante 48 horas. Luego del tiem-po de incubación se realizó el conteo directo de las colonias viables formadas expresado en UFC•g-1 de suelo.

'''Determinación de microorganismos degradadores''': Se utilizó el conteo de viables expre-sados en UFC g-1 de suelo en el medio propuesto por Finnerty (1994) y utilizando petróleo crudo Varadero de 11 API como única fuente de carbono y energía.

'''Producción de CO2 (Respirometría)''': Se determinó la cantidad de CO2 producido como in-dicador indirecto de la actividad microbiana, expresado en mg de CO2 producidos por m2 de suelo por días <ref>(Viale e Infante, 1997)</ref> .

'''Velocidad específica de crecimiento (µ)''': Se determinó en la fase exponencial del creci-miento, utilizando el modelo de crecimiento no restringido <ref>(López y Gódia, 1998).</ref>.

'''Determinaciones analíticas Gravimetría''': Se realizó por la metodología descrita en el Standard Methods, según la norma internacional APHA 5520. <ref>(APHA, 1995).</ref>.

'''Espectroscopía Infrarroja''': El extracto obtenido por gravimetría, fue resuspendido en 10 mL de n-hexano y sometido a espectroscopía infrarroja en un espectrómetro Konik, en celdas de Bak con separador de teflón de 0,025 mm.

'''Cromatografía gaseosa de alta resolución''': Para la determinación cuantitativa y cualitativa el petróleo residual después de interactuar con las bacterias, el hidrocarburo fue inyectado en un cromatógrafo de gases HP6890 con detector iónico de llama (GC/FID), con columna ca-pilar HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane de 30 m de longitud y 0,25 mm de diámetro interno impregnada con 0v-101. Se utilizó helio como gas portador. El gradiente de temperatura pro-gramado fue de 45-100oC a 3 oC min-1 y de 100-300oC a 5 oC min-1.

== Tratamiento estadístico de los resultados ==

Todas las experiencias se realizaron con tres repeticiones y una vez que se verificó el cumplimiento de la distribución normal de los datos según Kolmogorov y Smirnov y la homogeneidad de varianzas por el método de Bartlett, se realizó el análisis de varianza de clasifica-ción simple y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan (12) (Lerch, 1977) en la cual las medias que se diferencian se expresan con diferente letra. Todos los resultados fueron procesados con el paquete estadístico Statistica 4.0 y/o Excel 7.0 para Windows.

== Consecuencias de la contaminación con hidrocarburos ==

La manipulación y transporte de crudo y sus derivados ha incrementado notablemente los derrames de éstos en diferentes ecosistemas. Los suelos contaminados requieren de trata-mientos eficientes que permitan su recuperación y su posible reutilización.

Para las parcelas donde se evaluó el producto BIOIL-FC se obtuvo mayores µ de heterótro-fos totales y degradadores de hidrocarburos con respecto a las alcanzadas en el método tra-dicional de biorremediación (bioestimulación). Este comportamiento debe estar determinado por la adición de microorganismos degradadores de crudo que garantizan la multiplicación celular en estas condiciones y que son los responsables de la degradación de los hidrocarburos a diferencia de la variante de bioestimu-lación donde la actividad metabólica de la microbiota autóctona se inhibe por la presencia de estos contaminantes.

Para todas las variantes se detectó la disminución de los hidrocarburos en el tiempo, aunque en los casos donde se evaluó la bioestimulación tradicional el porcentaje de remoción fue significativamente inferior a las parcelas con BIOIL-FC, ya que la microbiota autóctona no debe presentar una alta velocidad de biotransformación.

En las parcelas con BIOIL-FC se logró una mayor eficiencia en la oxidación de los hidrocar-buros aunque para cada uno se alcanzaron diferentes porcentajes de remoción, de manera que para el fuel oil y gasolina de 85% de octanaje se alcanzaron 50 y 61% de remoción res-pectivamente en 28 días, mientras que para gasolina de 96 % se alcanzó un 98% en solo 15 días. Es conocido que las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en el petróleo influyen en su biodegradación. Así, un mismo microorganismo, puede presentar diferentes porcentajes de degradación ante crudos de diferente procedencia o composición química en iguales condiciones experimentales. 

La adición de microorganismos degradadores de crudo en las parcelas con BIOIL-FC facilita los procesos de bioconversión de estos en compuestos no tóxicos y biodegradables, aún cuando pudiera existir un agotamiento de algún nutriente. Estudios realizados por Núñez (2003) demostraron que una de las cepas integrante de ese biopreparado (Bacillus alcalop-hilus CBM-225) puede llevar a cabo la bioconversión de diferentes hidrocarburos presentes en el petróleo hasta CO2 y H2O.

Además, es importante destacar que en la formulación del bioproducto se incluye un bioten-sioactivo de tipo emulgente producido por una de las cepas que lo integran (Bacillus licheni-formis CBM-60), que favorece los procesos de emulsificación de hidrocarburos y por tanto una mayor disponibilidad de este sustrato como fuente de carbono (Ortiz, 2004).

La presencia de tensioactivos debe modular la hidrofobicidad de la superficie celular facili-tando la adhesión y colonización de la interfase (Köhler et al, 2000). Esto permite la incorpo-ración del hidrocarburo a la célula para llevar a cabo los procesos metabólicos que conduz-can a la multiplicación celular a partir de los hidrocarburos como única fuente de carbono y energía (Ábalos, 2001), sin que se produzcan reacciones adversas que inhiban la permeabi-lidad de la membrana celular como ocurre para tensioactivos obtenidos por síntesis química (Ducreux et al, 1994).

En cuanto al comportamiento de la concentración de CO2 se detectaron fluctuaciones a lo largo de la experiencia para cada hidrocarburo evaluado, aunque en general los máximos valores se alcanzaron en la parcela con BIOIL-FC, lo cual nos indica que en dicha parcela existió una mayor actividad microbiana pues existe un mayor porcentaje de remoción de hidrocarburos que no sólo debe estar relacionado con su oxidación; sino también por reac-ciones de biotransformación de este sustrato que facilitan su biodegradación posterior hasta CO2 y H2O.

El análisis cualitativo de la degradación de la gasolina de 96 % de octanaje demostró las diferencias entre los perfiles cromatográficos de este hidrocarburo sin degradar y los residuos luego del contacto con el bioproducto BIOIL-FC .

== Referencias ==

<references />

== Bibliografía ==

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