Northern blot
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Northern blot. Técnica de biología molecular utilizada para el estudio de la expresión génica mediante la detección de ARN específico en una mezcla compleja de ARN. Este método revela la identidad, la cantidad, la actividad y el tamaño del producto del gen en particular. Permite la identificación de ARN en tejidos y organismos en diferentes etapas de diferenciación y morfogénesis y además contribuye a la identificación de condiciones anormales, de enfermedad o infección, a nivel molecular.
Sumario
Antecedentes
La transferencia Northern o Northern blot, fue el primer procedimiento empleado para analizar el tamaño molecular y la abundancia de ARN selectivos en una mezcla de ARN. Fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stank en la Universidad de Stanford. Está basada en el proceso de hibridación en el que el ARN aislado se separa mediante electroforesis en gel, se transfiere a una membrana y se detecta mediante hibridación con una sonda de ADN o ARN. Los primeros métodos de detección involucraron sondas radiactivas. Posteriormente, se desarrollaron métodos utilizando detección quimioluminiscente, lo que proporcionó una técnica más segura con un mayor rango de detección que los métodos radiactivos. La técnica obtuvo su nombre debido a la similitud del proceso con el método Southern blot.
Principio
Como toda técnica de transferencia, el Northern blot comienza con la electroforesis para separar las muestras de ARN. Las moléculas de ARN se separan en función de la carga de estos ácidos nucleicos que es proporcional a su tamaño. Por tanto, la membrana de electroforesis separa la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el tamaño de la secuencia de ARN. Dado que las moléculas de gel son frágiles por naturaleza, las secuencias separadas se transfieren a membranas de nailon cargadas positivamente, siendo este el soporte más eficaz para realizar la hibridación pues los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. Una vez que se transfieren las moléculas de ARN, se inmovilizan mediante enlaces covalente formados con la membrana. Luego se agrega la sonda con una secuencia complementaria a todo o parte del ARN de interés.
Procedimiento
1. Extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizado. Las muestras pueden ser representativas de diferentes tipos de cultivo para comparación o pueden ser para el estudio de diferentes etapas de crecimiento dentro del cultivo. El ARNm se puede aislar mediante cromatografía para retener solamente los ARN con colas de poli(A).
2. Después de la extracción, las moléculas de ARN se separan en la unidad de electroforesis y se utiliza un gel de agarosa para la separación de ácidos nucleicos.
3. Las moléculas de ARN separadas se transfieren a la membrana de nailon. Esto se realiza mediante dos mecanismos, la acción capilar y la interacción iónica. La formamida se usa generalmente como tampón de transferencia, dado que esta reduce la temperatura de interacción de las muestras.
4. El ARN transferido a la membrana de nailon se fija luego mediante radiación UV y/o calor.
5. A continuación, se expone a una sonda de ADN monocatenaria marcada. Las bases de esta sonda se emparejarán con sus secuencias de ARN complementarias en la transferencia produciendo una molécula de ADN-ARN de doble hebra.
6. La membrana de transferencia se lava para eliminar la sonda no deseada.
7. La sonda marcada se detecta mediante quimioluminiscencia o autorradiografía. El resultado serán bandas oscuras en la película de rayos X.
Geles y sondas
Las muestras de ARN se separan usando geles de agarosa usando formaldehído como agente desnaturalizante. Los geles pueden teñirse con bromuro de etidio u otro agente intercalante y se visualizan generalmente bajo luz ultravioleta. Para fragmentos pequeños de ARN o micro ARN (miARN) pueden utilizarse geles de poliacrilamida ya que poseen un tamaño de poro más pequeño. Suele utilizarse además un patrón de ARN con muestras de tamaño conocido para poder estimar el tamaño de las muestras en estudio. Las sondas pueden ser complementarias a la totalidad o parte del ARN de interés. Pueden ser ARN, ADN u oligonucleótidos de 25 pares de bases complementarios al ARN diana. Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las que, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. Los rayos X pueden detectar tanto las señales radiactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radiactivos.
Aplicaciones
- De manera general, permite observar un patrón particular de expresión génica entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas.
- En estudios de expresión génica para observar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales. También en estudios de expresión génica en caso de rechazo del trasplante.
- En el diagnóstico de varias enfermedades, p. ej., Enfermedad de Crohn.
- Para la detección de microARN virales que desempeñan un papel clave en la infección viral. Aún sigue siendo un estándar de oro para el análisis de expresión de miARN.
- Para cribar recombinantes, detectando el ARNm formado por el transgén.
- Además de la determinación del tamaño del producto de un gen y de su abundancia relativa, la técnica puede sugerir empalme alternativo, motivos repetidos en la secuencia e indicar además deleciones o errores en el proceso de transcripción.
Ventajas y desventajas
Ventajas
Las ventajas de utilizar el Northern blot incluyen la capacidad de definir el tamaño de la cadena de ARN, la posibilidad de observar los productos del empalme alternativo y el uso de sondas con homología parcial. Además, la calidad y la cantidad de ARN se pueden medir en el gel antes de la transferencia, y las membranas se pueden almacenar y volver a probar años después de la transferencia. El uso de una sonda quimioluminiscente hace que la técnica sea más rápida y sensible y también reduce los riesgos para la salud en comparación con el uso de sondas radiactivas. Northern blot tiene una baja sensibilidad en comparación con la RT-PCR, pero una alta especificidad que reduce los falsos positivos.
Desventajas
Las desventajas incluyen la visualización de uno o pocos genes a la vez, lo que generalmente no es el caso en los microarreglos donde se pueden estudiar miles de genes. La técnica requiere una gran cantidad de secuencia de muestra de ARN diana, mientras que las técnicas más nuevas, como la RT-PCR en tiempo real, solo necesitan una única copia de ARN para la amplificación.
Un problema frecuente en la transferencia Northern es la degradación de la muestra por RNasas (tanto endógenas en la muestra como a través de la contaminación ambiental), que puede evitarse mediante la esterilización adecuada del material de vidrio y el uso de inhibidores de RNasa.
Fuentes
- https://www.mybiosource.com/learn/testing-procedures/northern-blotting/
- https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Northern-blot
- https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/northern-blotting
- https://www.news-medical.net/life-sciences/Northern-Blot-RNA-Blot.aspx
- http://wichosoto.blogspot.com/2012/12/unidad-v-tecnicas-de-diagnostico.html?m=1
