Crioconservación de germoplasma vegetal
| ||||
Sumario
Crioconservación de plantas
La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos fitogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costos que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o invitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.
Elementos de la crioconcervación
El elemento fundamental de la crioconservación es el Nitrógeno Líquido (NL) que se almacena y mantiene en tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.
Parte de la planta que se debe escoger
El material vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta: meristemos, yemas, ápices, tallos, callos, embriones somáticos, etc. Debe ser seleccionado de plantas sanas y, en el caso de proceder de material de cultivo invitro, los parámetros de cultivo se deben optimizar antes de la crioconservación, ya que el éxito de éste proceso de conservación va a depender tanto de los tratamientos utilizados antes de someter al material al NL, como de los utilizados una vez recuperado el material del NL.
Aspectos a tener en cuenta
Por lo tanto, es de extrema importancia poner especial atención en la composición de los medios de cultivo donde se incube el material vegetal antes y después de introducirlo en NL para su conservación. Para la manipulación del material es necesario utilizar recipientes de materiales resistentes a las bajas temperaturas, como los crioviales de polipropileno, donde el material vegetal que queremos conservar se deposita antes de introducirlo en el NL. Estos crioviales, con capacidades entre 1,2 y 15,0 ml, tienen un sistema de cierre a rosca especialmente diseñado para soportar la rápida conversión del NL a gas, que tiene lugar a temperatura ambiente, conversión que de otro modo produciría la explosión del contenedor. Debido a la facilidad con que se evapora el NL, es necesario controlar su nivel dentro de los tanques donde se almacena, para reponer las pérdidas y mantener estable la temperatura a –196 ºC y así asegurar la perfecta conservación del material.
Métodos clásicos de congelación
Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.El método de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento, consiste en someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10 ºC hasta –30 ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede realizarse bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5 ºC/5 min), o bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este último sistema mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura aparentemente continua. En el método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.
En general, conviene disminuir el contenido de agua del material vegetal para reducir los efectos de la formación de hielo en la congelación. Para ello el material se deshidrata parcialmente antes de la congelación.
Esta deshidratación previa se puede realizar con sustancias como el gel de sílice o medios con altos contenidos en glicerol o sacarosa. Así, se elimina un gran porcentaje del agua contenida en el material, teniendo en cuenta que la mayoría de los materiales mantienen su viabilidad si conservan entre el 16,5 % y el 20 % del agua existente inicialmente en fresco, siendo la determinación de la tolerancia a la deshidratación y los métodos que permiten alcanzarla uno de los objetivos más importantes en el estudio de la crioconservación.Por lo tanto, el método de congelación, la deshidratación y la utilización de sustancias crioprotectoras, de las que hablaremos más adelante, son los recursos existentes para reducir al máximo los daños que se pueden producir en la célula durante el proceso de congelación.
De forma resumida, aunque al formarse el hielo, ya causa por sí mismo daños celulares, estos daños se agravan debido a que se produce el fenómeno de recristalización, que consiste en que los cristales de hielo que se forman en el interior celular durante el proceso de congelación, se derriten y vuelven a formarse dando lugar a estructuras termodinámicamente más estables, es decir, cristales más grandes, con un efecto sumamente dañino ya que provoca una extensa destrucción de estructuras protoplasmáticas y la lisis celular.
En el sistema de congelación lenta, el hielo comienza a formarse desde el exterior hacia el interior celular. El agua sale hacia el exterior desde el citoplasma y la vacuóla, lo que provoca una diferencia de potencial osmótico que causa un aumento de la concentración de soluto en el interior celular, y esto va en detrimento de la posibilidad de supervivencia de la célula.
Desarrollar este sistema requiere un equipo complejo y de gran coste que controle la disminución gradual y exacta de la temperatura y el tiempo de permanencia del material en cada estadio térmico programado en el protocolo.
En el caso del sistema de congelación rápida ocurre lo contrario: se forma hielo desde el interior celular al exterior. El agua entra y la diferencia de potencial osmótico provocada es menor que en el método lento, por lo que los daños celulares que ocasiona una alta concentración de solutos no son tan críticos, si bien los daños por formación de hielo persisten.Aunque los métodos de congelación son variados, curiosamente casi todos los autores coinciden en que el proceso de descongelación debe realizarse de forma rápida para evitar la recristalización, siendo el método más habitual la inmediata introducción del material congelado en agua caliente a 38 ºC.
Para evitar los daños celulares se recurre generalmente al uso de crioprotectores. Los crioprotectores son sustancias de diferente composición (DMSO, glicerol o etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar, protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir, van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular. Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los procedimientos en que se utilizan crioprotectores, el material se somete frecuentemente a pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la vitrificación.
Nuevas Técnicas de crioconservación
La crioconservación clásica incluye la deshidratación inducida en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los materiales (se utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40 °C, así como diferentes tiempos de permanencia en esas temperaturas), la inmersión en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el almacenamiento a –80 °C. sin embargo, nuevas técnicas basadas en la eliminación parcial de agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado parcialmente a la técnica clásica. Estas nuevas técnicas son:
- vitrificación,
- encapsulación – deshidratación,
- encapsulación – vitrificación,
- precrecimiento,
- precrecimiento – deshidratación,
- desecación y
- enfriamiento de gotas.
1. Vitrificación
La vitrificación es un proceso que promueve la deshidratación celular y “solidificación” de líquidos en ausencia de cristalización (se evita la formación de cristales de hielo intracelulares que dañan los tejidos). Con la “solidificación” se induce un estado con una estructura molecular aleatoria pero que posee propiedades físicas y mecánicas similares a un sólido. Esta transición del agua líquida a una fase amorfa cambia la conformación estructural celular hacia una apariencia vidriosa. La vitrificación es realizada previa al congelamiento por medio de una sustancia crioprotectante. Esta técnica se recomienda para órganos complejos, como ápices de tallos, tejidos embriogénicos y cultivos de células. Una vez aplicada la solución líquida crioprotectante e inducida la vitrificación, los tejidos se congelan con NL y a continuación son almacenados a -80 °C. Durante el descongelamiento, los explantes generalmente se colocan en un baño de María a 40°C por uno a dos minutos y luego son lavados con medio de cultivo suplementado con sacarosa (0,4–1,2 M). Posteriormente, se colocan en el mismo medio de cultivo para su recuperación y regeneración en condiciones de adecuadas de luz.
2. Encapsulación – deshidratación
La encapsulación - deshidratación se ha utilizado con ápices de tallo y tejidos embriogénicos. Los explantes se precultivan en una solución con concentración alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG); después se les aplica una deshidratación en la cámara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se mantienen a -80 °C por el período de almacenamiento. El descongelamiento se realiza en baño de maría a 40°C por uno a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperación del crecimiento y regeneración.
3. Encapsulación – vitrificación
La encapsulación - vitrificación es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para la encapsulación. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los explantes en una solución con alta concentración de sacarosa, sino más bien por el uso de una solución crioprotectante (como se menciona en la primera técnica) a 0°C por unas horas, en su lugar, y por haber sido usado específicamente para meristemas. Los meristemas son encapsulados en medios que contienen altas concentraciones de azúcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se congelan inmediatamente con NL y se mantienen a -80 °C. El proceso de descongelamiento es similar al utilizado en la técnica de encapsulación – deshidratación.
4. Precrecimiento
El precrecimiento se ha utilizado específicamente para embriones cigóticos y somáticos. La técnica involucra el cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por varios días. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para luego almacenarlos a -80 oC. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica de encapsulación – deshidratación.
5. Precrecimiento – deshidratación
En el precrecimiento – deshidratación se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se desecan en flujo de aire y se congelan directamente en NL. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica mencionada para la vitrificación. Esta técnica también ha sido utilizada con callos embriogénicos de yuca (Manihot esculenta). Los callos se trataron previamente con una solución crioprotectante alta en sacarosa, se deshidrataron y, posteriormente se congelaron con NL.
6. Desecación
La desecación se ha utilizado sólo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen y óvulos. En ella se realiza primero la desecación de los tejidos o semillas en una cámara de flujo laminar o en un aparato con aire comprimido estéril o en sílica gel y, luego se congelan las estructuras con NL. Por ejemplo, en el caso de café, esta técnica permitió mantener la viabilidad de los embriones durante al menos un año. En el caso de tejidos haploides, como por ejemplo el polen de palma aceitera, la desecación fue realizada por medio de vacío. El polen fue mantenido en almacenamiento durante ocho años y, posteriormente, se observó que al germinar presentó una viabilidad del 62%. como comparación, este mismo polen se almacenó en frío (entre -10 y -20 °C) y a temperatura ambiente. En el primer caso, el polen permaneció viable durante un año y en el segundo caso, permaneció viable solamente durante siete días
7. Enfriamiento de gotas
Este Método se ha utilizado con ápices de tallos, los cuales son pretratados con una solución crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen gotas pequeñas de crioprotectante con el ápice en el centro. Los explantes se congelan directamente con NL. Un ejemplo exitoso fue realizado con ápices de tallo de 18 cultivares de ñame. Los ápices fueron desecados previamente con flujo de aire estéril y colocados en un medio de cultivo MS suplementado con glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M). Luego, estos se colocaron en una solución crioprotectante que consistió de medio líquido MS con glicerol (3,26 M), etilén glicol (2,42 M), DMSO (1,9 M) y sacarosa (0,4 M).
Referencia bibliográfica
- Sánchez-Chiang, Neiva y V.M. Jiménez. 2010. Técnicas de conservación in vitro para el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales. Agronomía mesoamericana 21(1):193-205. 2010
Fuentes
- www.encuentros.uma.es/.../crioconservacion.htm - En caché - Similares*
- www.ecured.cu/.../Crioconservación_de_germoplasma_vegetal - En caché*
