Polifenoloxidasas
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Las polifenoloxidasas. (PFO) que se encuentran en las plantas son las responsables de las reacciones de pardeamiento enzimático que ocurren durante el almacenamiento, manipulación y procesamiento de frutas y vegetales. Las polifenoloxidasas, también conocidas como tirosinasas, fenoloxidasasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilación de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrón, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican las características organolépticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad. (McEvily et al., 1992; Friedman, 1996; Matheis & Whitaker, 1984; Sanchez-Ferrer et al., 1995). Ocasionalmente, este cambio de color es deseado.
La actividad de las enzimas polifenoloxidasas presentes en frutas y vegetales puede ser inhibida por calentamiento o por remoción de alguno de sus componentes necesarios: O2, enzima, Cu2+ o sustrato (Guerrero-Beltrán et al., 2005). Agentes reductores, antioxidantes e inhibidores enzimáticos previenen el pardeamiento reduciendo químicamente las ortoquinonas a difenoles coloreados, inhibiendo la actividad de la enzima por disminución del pH, o quelando el Cu2+ en el alimento.
Sumario
Preparación del extracto enzimático
Las frutas fueron adquiridas en mercados comunitarios y conservadas a 4°C por 24 horas. La extracción de la enzima para pera y manzana se llevó a cabo siguiendo el procedimiento de Gauillard y Richard-Forget (1997) con algunas modificaciones. Se homogeneizaron a 4°C, 100 gramos de la fruta por 5 minutos en buffer fosfato 50 mM, pH=6,5 conteniendo ácido ascórbico 20 mM, etilenglicol 2% y Tritón X-100, 1%. La mezcla fue agitada a 4°C durante 12 horas. La suspensión fue centrifugada a 4000 rpm durante 15 minutos. Luego de separar el sólido, el líquido colectado se centrifugó nuevamente (15 minutos, 14000 rpm) en una centrífuga refrigerada Beckman J2-HS y el sobrenadante recolectado constituyó el extracto de la enzima utilizado para realizar los ensayos.
Actividad de polifenoloxidasa
La actividad de PFO fue determinada aplicando el método propuesto por Espin et al., (1995) utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV 160-A, de doble haz, con control de temperatura, equipado con celdas de cuarzo de 1 cm de camino óptico. Se determinó experimentalmente la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción para ambos pigmentos, formados por la oxidación de catecol por PFO de pera y manzana. Estos valores están de acuerdo con el rango de máxima absorción (390-480 nm) para quinonas reportado por Stauffer (1989). De esta manera, se determinó la actividad de la enzima midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm (pera) y a 400 nm (manzana). La velocidad inicial fue calculada a partir de la pendiente de la curva absorbancia versus tiempo. Se definió una unidad de actividad de PFO como el aumento de 0,001 unidades de absorbancia por minuto y por mL de enzima. Para los distintos ensayos se utilizaron 3 mL de solución buffer a los que se adicionó catecol, de manera tal que la concentración del mismo en la mezcla fue 50 mM, y 200 mL (pera) ó 25 mL (manzana) del extracto de la enzima. Se realizaron medidas de absorbancia a la respectiva longitud de onda de máxima absorbancia, cada 10 segundos, durante 10 minutos, a 25°C.
Estabilidad y pH óptimo
Se determinó en primer lugar el pH óptimo para la polifenoloxidasa de pera y de manzana analizadas en el rango de pH 4-5,5 en 50 mM de buffer acetato, 6,5-7,5 en 50 mM de buffer fosfato y 7,5-9,5 en 50 mM de Tris-HCl. El sustrato fue 50 mM de catecol, y se utilizaron 200 mL (pera) y 25 mL (manzana).La temperatura de trabajo fue 25°C. Para determinar el pH de estabilidad de la enzima, se incubó el extracto crudo de la misma en 3 mL de solución buffer (pH entre 4 y 9,5) durante 24 horas a 4°C. La actividad residual de la PFO fue determinada como porcentaje respecto de la actividad al pH óptimo, utilizando 50 mM de catecol como sustrato.
Actividad y estabilidad térmica
La actividad de PFO de pera y manzana fue obtenida a distintas temperaturas comprendidas entre 14 y 48°C al pH óptimo de cada una de ellas. La mezcla de buffer y sustrato fue incubada por 15 minutos hasta lograr la temperatura deseada. La actividad de PFO a la temperatura específica fue determinada espectrofotométricamente por adición del extracto de la enzima a la mezcla tan rápidamente como fue posible. A los efectos de determinar la estabilidad térmica de PFO, se incubó a las temperaturas 30, 40, 50, 60 y 70°C la solución de la enzima en 50 mM de buffer fosfato al pH óptimo de las enzimas analizadas durante 5, 10, 20 y 30 minutos. Luego la mezcla fue enfriada en baño de hielo, y una vez alcanzada la temperatura ambiente, se agregó el sustrato y finalmente se determinó la actividad leyendo absorbancia a 25°C. Los datos obtenidos a partir de los perfiles de actividad térmica se utilizaron para analizar parámetros termodinámicos relacionados con las reacciones de pardeamiento. Los datos para la inactivación térmica de la enzima fueron calculados comparando los cambios en la actividad luego del calentamiento a las distintas temperaturas respecto de la enzima sin calentar.
Cinética enzimática
Los datos cinéticos fueron representados como la inversa de la actividad versus la inversa de la concentración del sustrato, de acuerdo al método de Lineweaver y Burk (Lineweaver y Burk, 1934). Utilizando catecol como sustrato, trabajando a la temperatura de 25°C, y al pH óptimo de cada enzima, se determinaron los parámetros cinéticos: la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima (Vmáx), variando las concentraciones del mismo en la mezcla de la reacción entre 10-90 mM para pera y 21-350 mM para manzana.
Efecto de los inhibidores
Se analizó el efecto inhibitorio de ácido ascórbico (0,03-0,17 mM para pera y 0,03-0,31 mM para manzana), ácido benzoico (0,21-0,82 mM para pera y 0.20-0.80 mM para manzana) y cloruro de sodio (0,32-10,00 mM para pera y 0,32-2,20 mM para manzana) sobre la actividad de PFO de pera y manzana, frente a catecol como sustrato. Para tal fin, se realizaron experiencias utilizando 3mL de buffer pH óptimo, el extracto enzimático (200 mL - 25 mL) y catecol 50 mM como sustrato, en presencia de las distintas concentraciones de cada uno de los inhibidores, a 25°C.
CONCLUSIONES
Las modificaciones realizadas a la técnica de extracción utilizada por Gauillard y Richard-Forget 1997, fundamentalmente el agregado de tritón X-100, permitieron obtener un mejor rendimiento en la extracción PFO de las frutas analizadas. Los parámetros cinéticos obtenidos demuestran que PFO de manzana presenta una menor capacidad de pardeamiento frente a catecol que PFO de pera, mientras que los parámetros termodinámicos para las reacciones de pardeamiento resultaron ser del mismo orden. Estos datos, al igual que los valores de pH óptimo y estabilidad, como así también los de estabilidad y actividad térmica, contribuyen a predecir el comportamiento de la enzima presente en ambas frutas.
