Cólera Porcino
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Cólera porcino. Enfermedad causasa por un virus, uno de los patógenos de gran significancia económica que afecta la industria porcina en muchos países del mundo.
Sumario
Características del virus del Cólera Porcino
Desde la demostración de la naturaleza viral de la enfermedad (1903), al parecer transcurrieron algo más de 2 décadas hasta que a partir de 1929, aparecen en la literatura los resultados de los estudios sobre las características físico-químicas, biológica, morfológica, histopatológica y epidemiológica del virus del cólera porcino (CP). Todos los pestivirus poseen un amplio espectro de hospederos. Son de simetría cúbica de 40 nm de diámetro, la información genética esta contenida en una molécula de ácido ribonucleico (ARN) rodeado por proteínas que constituyen el cápside y que a su vez, está cubierta por una envoltura externa.
La mayoría de las cepas del virus de CP al igual que DVB y EF no son citopatogénicas en cultivo celulares, dificultando los trabajos de aislamiento si no se cuenta con cultivos celulares susceptibles y reactivos que permitan poner en evidencia la presencia viral, como los anticuerpos conjugados con fluorocromos (inmunofluorescencia) y/o enzimas (inmunoperoxidasa).
Los estudios del clonage y secuenciamiento de nucleótidos del ARN del virus, muestra no solamente la organización y estrategia de expresión de los genes localizados a lo largo del ARN viral, sino también, permite conocer el grado de relación a nivel molecular entre los virus que conforman el género pestivirus. La comparación de la secuencia de aminoácidos presentes en una porción del genoma de las cepas Alfort y Brescia muestran una similitud de 93%, entre la cepa NADL y Osloss de DVB, 87%; y entre Brescia y las dos cepas de DVB (NADL, y Osloss), 70%, indicando la estrecha raíz filogenética entre los 3 virus y la explicación de la relación antigénica observado tempranamente entre los pestivirus.
Proteínas del virus
La biogenésis de la partícula viral es un proceso complejo. Brevemente, luego de la adherencia y penetración del virus en la célula, el ARN viral es liberado en el citoplasma para su translación en un polipéptido de 3 898 aminoácidos, el polipéptido es procesado o "cortado" mediante enzimas de origen viral y celular en proteínas de diferente pesos moleculares para constituir la estructura viral. Estudios de purificación seguidos de precipitación de las proteínas por técnicas como: radioinmunoprecipitación, inmunoafinidad, electroforesis en gel de poliacrilamida y otras, han mostrado que el virus posee 4 proteínas estructurales denominadas en base a su peso molecular: La proteína 14 (p14) o proteína C, que no es glicosilada y gran parte de su secuencia es altamente conservada en todas las cepas de CP y DVB estudiadas. Esta proteína C, constituye el cápside o core, y como en todos los virus, rodea al ARN y posee propiedades antigénicas.
La p14 es precedida por la proteína 23 (p23) la cual tiene actividad de una proteasa y no constituye parte de la estructura vira], pero es importante en la biogenésis de la partícula viral.La proteína p14 es seguida por 3 proteínas altamente glicosiladas asociadas a la envoltura viral: la glicoproteína 44/ 48 (gp44/48) o proteína E2, la glicoproteína 33 (gp33) o proteína E3 y la glicoproteína 55 (gp55) o proteína E1.
Antígenos Virales
La relación serológica entre los pesti virus fue notado desde muy tempranamente." Se pensó también que los pestivirus constituía un grupo homogéneo, es decir, que no existían serotipos o variantes en cada uno de los 3 virus. Sin embargo el empleo de antisueros policlonales (anticuerpos contra toda la partícula viral) permiten observar variaciones en la prueba de virus neutralización cruzada con cada pestivirus. La aplicación de la ingeniería genética y el conocimiento de la estructura molecular de varias cepas del CP y DVB hicieron posible el desarrollo de los anticuerpos monoclonales o mabs (anticuerpos dirigidos contra un determinante de las proteínas del virus) constituyendo una poderosa herramienta para el análisis de la función biológica de cada uno de las estructuras del virus de CP y DVB.
La proteína El asociada a la envoltura viral, es la proteína de mayor importancia inmunológica, e induce la formación de anticuerpos neutralizantes en el animal expuesto, por lo que es la proteína viral de preferencia para el desarrollo de vacunas recombinante y/o vacunas de subunidades. Una de las primeras fue la vacuna recombinante de Pseudorrabia portando el gen que codifica la proteína El de la cepa Brescia. Los animales inmunizados con ésta vacuna, desarrollaron anticuerpos neutralizantes contra la El y fueron protegidos completamente contra el virus virulento de desafío. Empleando los mabs dirigidos contra la proteína El, se han identificado 4 dominios antigénicos, ó agrupamiento de epitopos (áreas del antígeno que entra en contacto con el anticuerpo). Estos dominios antigénicos son denominados: A, B, C, y D. El dominio A está dividido en 3 subdominios: Al, A2, A3, de los cuales, los subdominios Al y A2 no varían en todas las cepas de CP y poseen actividad neutralizante. El subdominio A3 así como el dominio D no son conservados en todas las cepas de CP estudiados, aunque el dominio D es conservado en las cepas China y Brescia. Los dominios B y C tienen también actividad neutralizante pero no son conservados pudiendo variar de cepa a cepa.
Fundamentalmente, el rol funcional de los epitopos para la neutralización del virus, varía en las diferentes cepas estudiadas; aunque los epitopos pueden estar presente físicamente en todas las cepas, no todos, pueden ser neutralizados por los mabs .30 Estas variaciones antigénicas podrían deberse a ligeros puntos mutantes en el genoma viral, conllevando a pequeños cambios en la glicoproteína como un mecanismo de persistencia viral ante fuertes presiones inmunológicas. El rol funcional de la proteína E2, presente también en la envoltura viral, al parecer difiere de la El, pues animales inmunizados con otra vacuna recombinante en la que el virus Vaccinia es vector del gen del CP que codifica la proteína E2, solo fueron protegidos parcialmente contra el virus virulento y la actividad de los anticuerpos neutralizantes inducidos fue débil comparados con aquellos inducidos por la E1.
Recientemente se ha demostrado que la proteína E2 es una ribonucleasa y como tal puede unirse al receptor manosa 6 fosfato presente en la membrana de la célula de los mamíferos, permitiendo la interacción virus-célula y facilitando la entrada del virus a la célula por endocitosis.1 Así mismo, se ha determinado que el gen que codifica la proteína E2 es única para los pestivirus y al parecer, o por lo menos parte del gen, fue adquirido por los pestivirus a través de procesos recombinantes con el gen que codifica una ribonucleasa de la célula hospedero.
Aún no se conoce bien la función de la proteína E3, pero probablemente representa la proteína de transmembrana que serviría de anclaje de la proteína E1.
Patogénesis
Existen diversos grados de virulencia entre las cepas del virus de CP pudiendo ser agrupados en: cepas virulentas, cepas de moderada virulencia y cepas de baja virulencia que determinan el cuadro clínico de la enfermedad. Las cepas de baja virulencia han emergido posiblemente debido a presiones inmunológicas y tienen gran significancia epidemiológica.
Una de las características fundamentales de estas cepas es su capacidad para persistir en el animal a través de las infecciones trasplacentarias y la predilección por el tejido linfoide y sistema nervioso central dando lugar a las infecciones subclínicas o atípicas. Estas características han sido claramente establecidas en el virus DVB.3'
Los casos agudos con elevada mortalidad son causados por cepas de alta virulencia y se presentan frecuentemente en porcinos de crianza no tecnificada donde los animales no son vacunados rutinariamente como sucede con los animales de la Sierra y Selva del Perú. En las granjas de crianza tecnificada, los casos agudos cuyos signos clínicos son bien conocidos, son esporádicos. Los hallazgos en nuestro laboratorio de virología sugieren que el CP subclínico es prevalente en muchas granjas tecnificadas. Es posible que la rápida repoblación de animales susceptibles y posibles fallas de orden sanitario favorecen la sobrevivencia del virus.
La infección de marranas con cepas de baja virulencia de CP antes de los 45 días puede ocasionar la muerte de los fetos o nacimiento de lechones inmunotolerantes infectados persistentemente. Estos lechones pueden morir durante los primeros días o semanas de vida por infecciones secundarias o pueden nacer aparentemente normales, pero son diseminadores del virus. Si la infección se produce después de los 45 días, el feto puede eliminar al virus. Las cepas de moderada virulencia pueden causar abortos, momificaciones fetales, malformaciones congénitas, mortinatos o lechones con signos clínicos de CP al momento de nacer o tan pronto después de nacer.
In vitro, la mayoría de las cepas de campo de CP y DVB, no causan lesión celular y en el caso de DVB son agrupados en biotipos no citopatogénicos y citopatogénicos. La diferencia entre ambos biotipos es la presencia de una proteína adicional en el biotipo citopatogénico, la proteína 80.
El biotipo citopatogénico surge por un mecanismo de recombinación entre el ARN del biotipo no citopatogénico adquirido por el animal durante el estado prenatal y el ARN de una cepa de DVB defectiva y citopatogénica que superinfecta al mismo animal. Estos animales desarrollan una forma clínica aguda y mortal, denominado Enfermedad de las Mucosas.
No existe en la literatura descripción del síndrome de la enfermedad de las mucosas en el porcino, pero sí existen animales con infecciones persistentes diagnosticados como casos de CP subclínico ó atípico.
Todos los pestivirus muestran afinidad por células del sistema inmune causando severas anormalidades inmunopatológicas como leucopenia, trombocitopenia, atrofia del timo, linfocitopenia a células B circulantes y destrucción de los centros germinales de los tejidos linfoides.
Susa43 demostraron que el progreso de la enfermedad esta asociado con el incremento significante de los granulocitos y una casi completa pérdida de los linfocitos B, mientras que la reducción de los linfocitos T fue menos impresionante. Realmente poco se sabe de la respuesta celular inmune del porcino al CP. La respuesta mediada por célula T ha sido reportada como ausente o difícil de detectar. El estudio de Kimman para determinar la respuesta inmune mediada por células T frente a la El, demostró que al menos ésta glicoproteína no es el antígeno principal para el reconocimiento por las células T; el mismo autor sugiere que deberían realizarse más experimentos empleando vectores que expresen otras proteínas del virus que pudieran inducir respuesta por células T. Por ejemplo, experimentos con la proteína E2 podría ayudar a comprender la interacción viruscélula y la patogénesis de la enfermedad del CP.
El virus del CP como todos los pestivirus son inmunosupresores y predisponen al animal, en especial jóvenes, a otras infecciones bacterianas y /o virales.
Diagnóstico de Laboratorio
La presentación subclínica o atípica de la enfermedad, hace imprescindible el uso del laboratorio para establecer el agente causal. A la fecha existen varios métodos para el diagnóstico del CP:
a).Detección de antígeno viral.
Este es un método rápido y se basa en la detección del antígeno viral (Ag) en secciones de tejidos como: tonsilas, bazo, riñón, gánglios linfáticos y porción distal del íleon, mediante la prueba de inmunofluorescencia directa (117) empleando un conjugado policlonal. Las tonsilas es el tejido de preferencia, aunque al parecer las cepas de baja virulencia pueden estar ausentes o por lo menos la intensidad de la fluorescencia, ser menor que la producida por las cepas de alta virulencia.La desventaja de la prueba de IF es su incapacidad de discriminar a los otros pestivirus, mas aún, ante la evidencia que el virus de la EF puede infectar al porcino con mayor frecuencia de lo esperado.Actualmente de dispone de paneles de mabs conjugados con enzimas como la peroxidasa, inmunoperoxidasa (IP), que están siendo usados en muchos laboratorios del mundo incluyendo la Facultad de Medicina Veterinaria de la Univ San Marcos. Estos reactivos permiten identificar al virus del CP Y mas aún identificar el origen del virus, es decir, si es vacunal, o si es virus de campo, sobre todo en animales procedentes de granjas tecnificadas.
Se ha descrito también el método de Elisa para captura de Ag en muestras de tejidos como sangre y otros. Este es un método que permite trabajar numerosas muestras en corto tiempo. Sin embargo, los métodos de IF e IP son los más usados.
b).Aislamiento viral.
Es el método más sensible para el diagnóstico de CP. La desventaja es que se necesita de un laboratorio equipado con cultivo celular y que cuente con técnicas y reactivos necesarios para evidenciar la presencia del virus, pues la mayoría de las cepas de campo no son citopatogénicas.
c).Detección de ácido nucleico viral.
El método de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), un método simple, está siendo usado con fines diagnósticos en muchas enfermedades, por su rapidez, alta especificidad y sensibilidad.
El fundamento del PCR radica en la síntesis y amplificación de una determinada secuencia del ARN del virus de CP mediante la enzima transcriptasa reversa. El PCR esta siendo usado para el diagnóstico de CP y al parecer será el método de preferencia del futuro.
d).Detección de anticuerpos.
La prueba serológica es de gran utilidad ante la sospecha de infecciones subclínicas en una granja, para evaluar la respuesta inmune en los reproductores y para realizar estudios epidemiológicos. Los anticuerpos neutralizantes pueden ser medidos mediante la prueba de virusneutralización, inhibición de focos fluorescentes, y ELISA en todas sus variantes.
El método de ELISA-CTB descrito por Wensvoort está siendo usado en muchas partes del mundo para la detección de anticuerpos. En este caso se utilizan dos mabs, el primero captura al Ag, y luego a este complejo se añade el suero problema. Si existen anticuerpos contra el CP se fija al Ag, y al añadir el segundo mab, conjugado con una peroxidasa, no hay reacción (ausencia de color) pero si no hay anticuerpos en el suero problema, el segundo mab se fija al Ag y se observa reacción (presencia de color).
Actualmente, ante el uso evidente de las vacuna recombinantes, una técnica serológica que permita diferenciar a los anticuerpos producidos por la vacuna o por el virus de campo, será de gran utilidad, como ocurre en los países que están en proceso de erradicación del CP.
Control del Cólera Porcino
El Perú cuenta con Normas para el control del cólera porcino dada el 26 de agosto de 1982, que tiene como una de sus bases legales la Ley 4638 (21 de marzo de 1923) de la Policía Sanitaria. En ella se dan directivas para el diagnóstico, prevención y control sobre esta enfermedad. Sin embargo, ante los avances sobre los conocimientos de la biología del virus, patogénesis, inmunógenos y técnicas diagnósticas, sería oportuno la revisión y adecuación a la situación actual de la enfermedad.
En general, el control del CP debe basarse en los siguientes aspectos:
a.)Buen manejo sanitario
b.)Diagnóstico de laboratorio
Sin duda un componente fundamental en el control del CP es el laboratorio de diagnóstico, el cual debe contar con todas las técnicas rápidas y específicas para el diagnóstico y para llevar a cabo la vigilancia permanente.
c.)Inmunización
La inmunización tiene por objetivo interrumpir la cadena de transmisión de la enfermedad. En el Perú, no existen un programa de vacunaciones contra CP obligatorio a nivel nacional, la inmunización sistemática solo se llevan a cabo en granjas tecnificadas, utilizando vacunas a virus vivo modificado por pasajes en conejos o preparadas en cultivos celulares de origen porcino y ovino, empleando como virus semilla la cepa China.
A la fecha existen vacunas recombinantes y vacunas de subunidades a base de la proteína El y cuya eficacia han sido probadas en el laboratorio y en el campo y que pronto estarán en el mercado.La inmunización debe ser obligatoria a nivel nacional.
d.)Reglamentación del transporte interno de los porcinos
Los porcinos que son llevados a la Sierra o Selva para fines de mejoramiento, deben tener títulos de anticuerpos contra CP en respuesta ala vacunación para evitar la introducción de animales con infección persistente a áreas libres de la enfermedad.
e.)Detección y eliminación de los animales portadores
Para éste propósito se requiere la implementación inmediata de una técnica serológica como ELISA. La serología debe hacerse en los animales del plantel de reproductores. Los animales que no seroconvierten después de la vacunación serán sospechosos de inmunotolerantes y portadores del virus.
f. Vigilancia epidemiológica permanente
