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Microinjerto de ápices caulinares in vitro

Microinjerto de ápices caulinares in vitro
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Microinjerto de ápices caulinares in vitro. Las enfermedades causadas por virus, viroides, bacterias y fitoplasmas, que causan importantes pérdidas económicas, se encuentran ampliamente diseminadas en el mundo como consecuencia de la propagación por injerto y de la falta de control sanitario en los árboles tomados como fuente de yemas. Aunque existen insectos vectores para algunas de esas enfermedades, ha sido sin duda el hombre el principal transmisor de las mismas.

Esos patógenos presentes en las plantas de cítricos influyen negativamente y de forma determinante en su producción, longevidad, vigor y calidad de la fruta, además de que limitan el uso de varios patrones.

Para controlarlos es imprescindible contar con material de propagación certificado genética y sanitariamente que garantice el empleo de material de alto potencial productivo, además de adoptar las medidas necesarias para disminuir en lo posible los daños causados por los patógenos transmisibles por vectores, en aras de lograr plantaciones con elevada producción y de buena calidad.

Vías de obtención de material de propagación libre de patógenos

Selección de árboles en campo

Es probable encontrar en las plantaciones, mediante el diagnóstico con las pruebas apropiadas, árboles que no presenten enfermedades y considerar entonces la factibilidad de tomarlos como fuente de material de propagación de determinados clones. No obstante, resulta difícil tener éxito en esta búsqueda y en relación con los conocimientos actuales, con el desarrollo de técnicas altamente confiables en la eliminación de patógenos conocidos y por las garantías más amplias que ofrecen, como se explica más adelante, no se recomienda esta vía para obtener material sano de cítricos.

Termoterapia

La termoterapia es el método clásico de obtención de plantas libres de patógenos. Consiste en someter las plantas infectadas, durante períodos comprendidos entre semanas y meses, a temperaturas elevadas (38 – 40 ºC) a las que se inactivan los patógenos termosensibles.

Aunque resulta exitosa para eliminar un número considerable de patógenos en material de cítricos infectado, la termoterapia presenta como inconvenientes que algunos cultivares son sensibles a las altas temperaturas y que es ineficaz en la eliminación de ciertos patógenos como los virus yellow vein y dweet mottle, Spiroplasma citri causante de stubborn, exocortis y cachexia, estos dos últimos viroides de amplia difusión.

Plantas de origen nucelar

  • Germinación convencional de semillas de variedades poliembriónicas

Es conocido que los patógenos en su mayoría no se transmiten a las semillas de los frutos de un árbol enfermo, por lo que las plantas que se logran al sembrar dichas semillas estarán libres de patógenos. La poliembrionía característica de la mayor parte de los cítricos permite obtener plantas sanas por esta vía mediante la selección de los descendientes nucelares. Se han desarrollado métodos bioquímicos y moleculares que permiten distinguir entre la progenie a estos descendientes - que son los que interesan por presentar el mismo genotipo de la planta de la que proceden – de los de origen cigótico, pero como inconveniente de esta vía debe señalarse el largo período que es preciso que transcurra hasta que los caracteres juveniles (marcada espinosidad, excesivo vigor de las plantas, fruta de baja calidad y tardía entrada en producción) de las plantas nucelares disminuyan y sean aceptables para la propagación comercial.

  • Cultivo in vitro de óvulos de variedades poliembriónicas sin semillas y de nucelas de variedades monoembriónicas

Con el propósito de lograr descendientes nucelares en estos casos en que no es posible por la siembra de semillas a que se hizo referencia anteriormente, se desarrollaron estos cultivos in vitro a partir de los cuales se obtienen plantas libres de patógenos, mas con el mismo inconveniente de la juvenilidad que caracteriza a las plantas nucelares arriba explicado, a lo que se suma la presencia de anomalías en una considerable proporción de las plantas logradas, especialmente a través del cultivo de nucelas in vitro.

Microinjerto de ápices caulinares in vitro

El cultivo de ápices caulinares in vitro que resulta eficaz para obtener plantas libres de patógenos en numerosas especies vegetales, no ha resultado exitoso en los cítricos por no haberse alcanzado regeneración de plantas completas a partir de esos ápices. Como alternativa para lograr plantas de cítricos libres de patógenos, se ha desarrollado la técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro que constituye en la actualidad la vía por excelencia para disponer del material de propagación certificado que se lleva a las plantaciones comerciales, así como la forma de garantizar el estado sanitario de las accesiones de un banco de germoplasma de cítricos para su utilización en los programas de mejoramiento genético y para la conservación adecuada de estos valioso recursos fitogenéticos.

Esta técnica ha demostrado ser muy eficaz en la eliminación de todos los patógenos probados hasta el presente, incluyendo los que no pueden ser eliminados por termoterapia, además de que las plantas sanas obtenidas por esta vía presentan características idénticas a la planta madre.

Procedimiento

El procedimiento descrito por Navarro y col. (1975) para el microinjerto de ápices caulinares in vitro consta de las etapas que a continuación se relacionan.

Preparación del patrón

Es necesario disponer de patrones logrados por germinación de semillas in vitro, aunque también se pueden emplear como patrones plantas micropropagadas.

Las semillas que se utilicen deben proceder de árboles libres de patógenos, al menos de los que se transmiten por semillas.

Teóricamente cualquier patrón que sea compatible con la variedad que sobre él se injerte puede ser usado para el microinjerto. A pesar de que el patrón más utilizado ha sido el citrange ‘Troyer’ (Poncirus trifoliata (L.) Raf. X Citrus sinensis (L.) Osb.) se han empleado también Poncirus trifoliata, limón ‘Rugoso’ (Citrus jambhiri Lush.), cidro ‘Etrog’ (Citrus medica L.), Citrus macrophylla Wester, entre otros patrones, atendiendo a diversas causas como son la facilidad que ofrecen los trifoliados en la identificación de los rebrotes del patrón para ser eliminados, a la compatibilidad a la que se hacía referencia y a los resultados del empleo de patrones más vigorosos.

Se eliminan manualmente los tegumentos de las semillas, se tratan por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 0,7 % durante diez minutos para la esterilización de su superficie y se enjuagan varias veces con agua destilada estéril.

Las semillas se siembran en tubos de ensayo con medio de germinación compuesto por las sales minerales de Murashige y Skoog (MS) solidificado con agar, donde permanecen en oscuridad constante a 27- 30 ºC durante alrededor de dos semanas hasta que las plántulas alcanzan su desarrollo óptimo para su uso en el microinjerto.

Preparación del ápice

Los ápices caulinares para el microinjerto pueden obtenerse de diversas fuentes de brotes de los árboles enfermos seleccionados: directamente en árboles que se encuentren en activa brotación vegetativa; plantas injertadas de las selecciones de interés que se mantienen en bolsas o macetas y en las que puede inducirse la brotación de sus yemas defoliándolas totalmente dos semanas antes de la fecha del microinjerto; y vástagos cultivados in vitro como los que se recomiendan para el intercambio de material de propagación vegetativo.

Se utilizan brotes no mayores de 5 cm para evitar ápices degenerados o en estado de abscisión. A cada brote se le eliminan las hojas mayores y se separa la parte terminal con una longitud de 1 cm, se realiza la esterilización de superficie por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 0,25 % más 0,1 % de Tween 20 durante cinco minutos y se enjuaga repetidas veces con agua destilada estéril.

En condiciones asépticas y con el auxilio de un microscopio estereoscópico, se eliminan las hojas restantes con excepción de los tres primordios foliares más jóvenes.

Microinjerto

Trabajando en condiciones de esterilidad, la plántula patrón se extrae del tubo de ensayo, se decapita dejando aproximadamente 1,5 cm del epicotilo, se acorta la raíz hasta 4-6 cm y se eliminan los cotiledones junto con sus yemas axilares. Aunque se han ensayado diversas formas de injerto, se utiliza mayormente la incisión T invertida con dimensiones de 1 mm en el extremo del epicotilo decapitado, a través de la corteza hasta el cambium, con cuidado de no dañar la médula.

Con el empleo de instrumentos de microdisección , se aisla el ápice caulinar menor de 0,2 mm compuesto solo por el meristemo apical más los dos o tres subyacentes primordios foliares y se coloca con la superficie de corte basal en contacto con la superficie cortical horizontal de la incisión T invertida practicada en el patrón.

Los cortes para la preparación del patrón y el aislamiento del ápice deben ser tan perfectos como sea factible y las operaciones del microinjerto deben efectuarse con la máxima rapidez posible para evitar la desecación de los tejidos.

Se ha demostrado que aunque se logra mayor prendimiento del microinjerto con el empleo de ápices caulinares mayores, existe una relación inversa entre el tamaño de estos y el porcentaje de plantas sanas obtenidas.

Además del tamaño del ápice, otros factores influyen decisivamente en el prendimiento del microinjerto como son el patrón escogido, la variedad del ápice microinjertado, la utilización de patrones etiolados, la edad de las plántulas patrón y la destreza manual del operador.

Mantenimiento de las plantas microinjertadas

Las plantas microinjertadas se cultivan en medio líquido compuesto por las sales minerales MS, las vitaminas de White, 100 mg/L de meso-inositol y 75 g/L de sacarosa, en tubos de ensayo con soporte de papel donde se colocan individualmente y se mantienen a 27 ºC con un régimen de iluminación de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, aunque debe resaltarse que también se ha conseguido un desarrollo satisfactorio de los microinjertos en cuartos de cultivo con luz natural.

Trasplante de los microinjertos logrados

A las 5-8 semanas, con al menos dos hojas expandidas, las plantas microinjertadas pueden ser llevadas a condiciones ambientales externas, mediante su trasplante directamente a macetas con un sustrato apropiado y en condiciones de humedad y sombreado que favorezcan su desarrollo, o injertándolas sobre patrones vigorosos, variante que se utiliza en diversos laboratorios con el objetivo de minimizar pérdidas en este importante paso y acelerar el desarrollo de los microinjertos para disponer más rápidamente del material de propagación libre de patógenos deseado.

La labor del microinjerto se complementa obligatoriamente con las pruebas de diagnóstico de patógenos que sea preciso realizar en cada caso, para garantizar la calidad sanitaria del material de propagación obtenido. De hecho, al hacerse referencia a una planta sana o libre de patógenos, lo que se puede asegurar es que está libre de los patógenos para los que las pruebas de diagnóstico realizadas fueron negativas.

Se ha demostrado que los principales patógenos transmisibles por injerto en los cítricos pueden ser eliminados a través del microinjerto de ápices caulinares in vitro. Los patógenos que más fácilmente se eliminan por esta vía son exocortis, cachexia, stubborn, así como los virus causantes de la tristeza de los cítricos, infection variegation y vein enation, con éxito en el 100 % de los casos o próximo a esa cifra, mientras son más difíciles de eliminar con esta técnica tatter leaf, dweet mottle, psorosis, entre otros. Sin embargo, se ha encontrado que si se aumenta hasta 32 ºC la temperatura a la que se desarrollan los brotes que se emplean en el microinjerto, se elevan considerablemente los porcentajes de plantas sanas que se obtienen a partir de plantas enfermas con algunos patógenos, por lo que en varios programas de saneamiento se emplea de forma rutinaria la combinación del microinjerto con tratamientos de termoterapia.

También se ha demostrado la eficacia de la técnica de microinjerto para eliminar las bacterias causantes de cancrosis y huanglongbing (ex greening) y se ha obtenido el 100 % de plantas sanas cuando se han utilizado brotes desarrollados a 32 ºC por cultivo in vitro de vástagos de plantas enfermas. Igualmente ha sido muy eficaz el empleo del microinjerto para eliminar la bacteria causante de la clorosis variegada de los cítricos.

Además del patógeno de que se trate y de la temperatura a la que se desarrollen los brotes, como se señaló anteriormente, el tamaño del ápice microinjertado influye en los porcentajes de plantas sanas resultantes de la técnica de microinjerto.

Independientemente de los porcentajes que se alcancen en el prendimiento de los microinjertos y en el saneamiento, lo que se pretende es obtener una fuente de material de propagación libre de patógenos a partir de una selección infectada, lo que puede alcanzarse con un mínimo de plantas microinjertadas logradas que puedan suministrar yemas para la propagación de la variedad saneada, una vez verificado esto mediante las pruebas de diagnóstico que se considere oportuno realizar. Así, las plantas sanas obtenidas constituyen el punto de partida para la producción de material de propagación certificado dentro de un programa de certificación de cítricos.

Aplicaciones de la técnica de microinjerto

La técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro ha demostrado ser la vía más eficaz para obtener material de propagación vegetativo libre de patógenos, ya que con su utilización se pueden eliminar aquellos para los que no resulta eficaz la termoterapia y se evitan los caracteres juveniles que presentan las plantas nucelares, además de que las plantas obtenidas a través de microinjerto muestran características morfológicas idénticas a las de los árboles de origen.

Asimismo, se puede garantizar el estado sanitario de una colección de variedades sometiendo al microinjerto a las accesiones que la integran; de esta forma se posibilita la conservación adecuada de estos valiosos recursos naturales que a su vez resultan más útiles para las investigaciones relacionadas con el fitomejoramiento y el intercambio internacional de germoplasma.

Por otra parte, sobre la base del empleo del microinjerto, se ha propuesto un método a través de cultivos in vitro para la introducción de material de propagación vegetativo de cítricos con mínimo riesgo de importar enfermedades o plagas con resultados satisfactorios. Este método ha sido utilizado con éxito en varios países.

Es importante señalar que, además, ha sido posible mediante el microinjerto separar distintos patógenos y razas diferentes de un patógeno presentes en una misma planta, lo cual resulta de interés para investigaciones relacionadas con la virología de los cítricos.

Por último, debe resaltarse que la técnica de microinjerto desarrollada para el saneamiento de cítricos ha tenido también aplicación en otras especies leñosas de frutales.

Considerando todas las ventajas del microinjerto de ápices caulinares in vitro sobre otras vías para la obtención de material de propagación libre de patógenos, y teniendo en cuenta los importantes resultados que tanto en el saneamiento como en la introducción de variedades se han alcanzado en diversos países citrícolas, se recomienda el empleo de esta técnica como base de los programas de saneamiento dentro de los sistemas de producción de material de propagación certificado de cítricos que urge desarrollar en todos aquellos países donde la propagación aún no se realiza sobre la base de una garantía sanitaria.

Fuente

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  • Mas, O., R. Pérez, A. Ríos y M, C. Pérez. 1994. Introducción en Cuba de variedades de cítricos utilizando técnicas de cultivo in vitro. Comunicación breve. Levante Agrícola XXX (328): 223. 3.
  • Navarro, L. C. N. Roistacher and T. Murashige. 1975. Improvement of Shoot-tip Grafting in vitro for Virus-free Citrus. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 100(5): 471-479. 4.
  • Navarro, L. 1991. Citrus Shoot-tip Grafting and its Applications: a Review. Proc. Int. Soc. Citriculture 1: 452-456. 5.
  • Navarro, L., L. Civerolo, J. Juárez and S. M. Garnsey. 1991. Improving Therapy Methods for Citrus Germplasm Exchange. Proc. 11th Conf. IOCV, p. 400-408. 6.
  • Navarro, L. y J. Juárez. 2001. Aplicaciones de la biotecnología en los cítricos y otros cultivos. Fruticultura Profesional, número 118 (mayo-junio): 19-32.
  • Ollitrault, P. y O. Mas. 2000. Los recursos genéticos de cítricos y la biotecnología. Carta Circular de la RIAC, número 16: 4-8.