Microscopía

Microscopìa Concepto: La microscopia es la ciencia que se ocupa de los usos y de las aplicaciones interpretativas de los microscopios, los cuales hacen posible que partículas muy pequeñas sean percibidas por el ojo humano.

Historia

La historia de la microbiología va estrechamente ligada a la de la microscopia. La aparición de las lentes, la observación de protozoos y bacterias, y el desarrollo científico- técnico en el campo de la microscopia, han ido marcando hitos de avance en el conocimiento de los organismos vivos imperceptibles por el ojo humano a simple vista. Según Barrer, la microscopia tiene dos objetivos principales; el primero es la formación de una imagen aumentada con la menor cantidad posible de defectos ópticos y el segundo, lograr el contraste. En este capítulo, que dedicamos a los principios básicos de la microscopia y su aplica- ción en los campos de la microbiología y de la parasitología médicas, expondremos algunas definiciones y conceptos fundamentales, así como describiremos ciertas técnicas de microscopia de fácil acceso, señalando sus aplicaciones, ventajas y limitaciones.

Funciòn

El poder de resolución de un microscopio es la distancia que debe separar a dos fuentes luminosas puntiformes, si estas se han de ver como dos imágenes distintas. El ojo humano logra la resolución cuando el ángulo visual es lo bastante amplio para que los rayos de luz, procedentes de dos puntos distintos, encuentren diferentes elementos receptores en la retina. De este modo la distancia lineal entre objetos o poder de resolución del ojo humano desnudo es de aproximadamente 0,07 mm. Una de las propiedades más importantes de la luz es la longitud de onda, representada por la letra griega lambda (λ). En la luz empleada para la observación microscópica, dicha propiedad está estrechamente relacionada con la resolución que puede obtenerse. El límite de resolución (d ) depende de la apertura numérica del objetivo (AN) y de la longitud de onda de la luz usada (λ), lo cual está definido por la fórmula matemática:

• 

  fórmula matemática

Por lo tanto, la mejor resolución (“dmin” más pequeña) se obtiene usando la menor longitud de onda y el lente objetivo de la mayor apertura numérica posible. La amplificación útil de un microscopio es aquella que permite observar las más peque- ñas partículas susceptibles de resolución. Es importante señalar que una mayor amplifica- ción no daría siempre una mejor resolución de los detalles y conllevaría la reducción del área de observación, los llamados campos microscópicos.

Clasificacion de Microscopios

Microscopios Luminosos

Son los microscopios que utilizan luz visible con el fin de hacer observable un espéci- men. Entre estos microscopios se encuentran:

Microscopio luminoso simple

Está compuesto por una sola lente de aumento, de gran campo, que produce una imagen vertical. Su uso está limitado por su baja AN y su resolución es de unos 10 m. Estas lentes son útiles para la disección, para las mediciones y para el examen de las reacciones de aglutinación. En los laboratorios de microbiología se utilizan en los contado- res de colonias, donde aparecen adaptadas a una base e iluminación apropiadas para el objetivo que se persigue con el equipo. Algunos de los problemas que se presentan con el uso de una sola lente, como el no poder colocar el campo total dentro del foco y la presencia de anillos coloreados alrededor de los objetos observados, se resuelven en la actualidad con el uso de varias lentes com- binadas.

Microscopio luminoso compuesto

Consta, por lo menos, de dos sistemas de lentes. El objetivo, de múltiples compartimentos con breves longitudes focales, que forma una diminuta imagen real invertida en el plano focal de otra lente; y la lente ocular, la cual magnifica la imagen para que el observador pueda resolverla. Estos microscopios pueden tener uno o dos lentes oculares, denominándose microscopio monocular o binocular respectivamente. El objetivo es el determinante más importante de la calidad de la imagen producida por el microscopio y es necesario corregir en cada una de ellas una o más aberraciones o errores. Además del grado de corrección de una lente, la calidad de la imagen está determinada por su AN. Los microscopios compuestos tienen varios objetivos intercambiables, con diferentes poderes de amplificación.

El mecanismo de enfoque consta de un tornillo macrométrico, con el que se cambia rápidamente la distancia entre el objetivo y el espécimen, y de un tornillo micrométrico, para cambiar lentamente dicha distancia. Para la microscopia en campo luminoso de gran resolución, los objetivos de inmersión (AN = 1,2 a 1,4 ) son muy útiles. El aceite que se emplea para la inmersión de estos objetivos es un líquido viscoso que no seca y es refractivamente estable, con un índice de refracción de 1,51. El aumento total de un microscopio luminoso se calcula multiplicando el poder de aumento del objetivo por el de la lente ocular. Ejemplo: ocular (10X) y objetivo (40X): 10 x 40= 400 diámetros de aumento. Los microscopios usados en bacteriología utilizan, por lo general , los objetivos de 90 o 100 diámetros de aumento con oculares de 10 diámetros, amplificando de 900 a 1 000 veces; por lo que una partícula observada de 0,2 m de diámetro puede ser amplificada hasta 0,2 mm, resultando claramente visibles. En los microscopios luminosos el poder de resolución puede mejorarse mediante el uso de luz con longitud de onda más corta, de aproximadamente 0,2 m, que permite una resolu- ción de partículas de 0,1 m de diámetro. La microscopia en campo iluminado o claro es la más usada para la observación de frotis coloreados, pero puede también emplearse para examinar características morfológicas y la movilidad de los organismos en preparaciones denominadas “gotas colgantes” o “en fresco” (suspensión del microorganismo en una gota de líquido, colocada sobre lámina por- taobjeto y cubierta con lámina cubreobjeto).

Otro ejemplo de microscopio compuesto de gran utilidad en los laboratorios de micro- biología y parasitología médicas, es el microscopio estereoscópico, el cual combina dos microscopios compuestos que producen imágenes separadas para cada ojo a un ángulo ligeramente diferente. Pueden contar con uno o con dos objetivos. Puede utilizarse luz reflejada o luz transmitida, pero como no tiene condensador, el tipo y la intensidad de la iluminación son factores limitantes. Estos microscopios son muy útiles para examinar las características de las colonias de bacterias, hongos, cultivos de tejidos y otros organismos parásitos.

Clasificacion de Microscopias

Microscopia De Contraste De Fases

Se fundamenta en el hecho de que las ondas luminosas que pasan a través de objetos transparentes, como las células, emergen en fases diferentes dependiendo de las propieda- des de los materiales que atraviesan. En 1934, Zernike desarrolló métodos ópticos para separar las ondas luminosas inciden- tes y difractadas, amplificando así la diferencia de fases entre ellas. Un sistema óptico especial convierte esta diferencia de fase en una diferencia de inten- sidad; de este modo, unas estructuras aparecen más oscuras que otras. En el microscopio de contraste de fases, el condensador tiene un diafragma anular que produce un centro luminoso hueco y el objetivo está acondicionado para acentuar los cambios de fases producidos en la muestra. Una ventaja es la posibilidad de diferenciar las estructuras internas de células vivas, pues con el microscopio ordinario lo usual es la observación de preparaciones de materiales muertos y teñidos.

Microscopia En Campo Oscura

Se utiliza el mismo microscopio luminoso, empleando un condensador cuya apertura numérica es mayor que la del objetivo y bloquea los rayos de luz directos, así como desvía la luz de un espejo al lado del condensador en un ángulo oblicuo. De esta manera se crea un campo oscuro que produce contraste contra los bordes destacados de los microorganismos y se origina cuando los rayos oblicuos son reflejados del borde del microorganismo hacia arriba, al objetivo del microscopio. Como los objetos luminosos contra fondo oscuro son percibidos por el ojo más fácil- mente, este tipo de iluminación para observación microscópica es útil para visualizar flagelos bacterianos y bacterias espirilares mal definidas con la microscopia de campo claro y de contraste de fase.

Microscopia Por Flourecencia

Este tipo de microscopio se basa en el principio de remoción de la iluminación incidente por absorción selectiva, transmisión de la luz absorbida por la muestra y reemitida con diferente longitud de onda. Los compuestos capaces de absorber luz de una determinada longitud de onda y de emitir luz de mayor longitud de onda, se denominan fluorocromos. Las longitudes de onda absorbidas y emitidas dependen de los fluorocromos utilizados. El rayo luminoso emitido desde la fuente pasa por un filtro de excitación que elimina las longitudes de onda que no sirvan para excitar al fluorocromo utilizado. La luz que la muestra hace fluorescente se transmite a través de un filtro de barrera que elimina del rayo a la longitud de onda incidente. De esta manera, sólo la luz que ha interactuado con la muestra con un cambio de longitud de onda, contribuye a la intensidad en el plano de la imagen.

Diferentes fluorocromos son empleados en la práctica, entre los cuales podemos men- cionar la auramina y la naranja de acridina, de uso en la tinción directa de microorganismos. En los laboratorios de microbiología médica se utilizan para la detección de microorganismos en hemocultivos y para la observación de bacilos acidorresistentes en frotis. Otros fluorocromos, tales como isotiocianato de fluoresceína, pueden ser conjugados a anticuerpos y se emplean en los laboratorios en técnicas conocidas como inmunofluores- cencia, que nos permiten, con una alta sensibilidad y especificidad, localizar antígenos en una muestra dada. Dos técnicas básicas de inmunofluorescencia son usadas en microscopia: directa e indirecta. Con la técnica directa, la muestra en estudio se fija a una lámina portaobjeto y se le adiciona un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína. Si el antígeno corres- pondiente se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo se le une. La lámina se observa al microscopio por fluorescencia y el fluorocromo unido a la inmunoglobulina y a su antígeno, emite luz de una longitud de onda visible. El observador la percibe con un color brillante en intenso contraste con los no coloreados y con el fondo de la preparación.

La inmunofluorescencia directa es muy utilizada en los laboratorios para identificar, de manera relativamente rápida, antígenos virales en células de especímenes clínicos (virus respiratorios, herpesvirus, etc.), y para el diagnóstico de otros agentes microbianos tales como:

• Bordetella pertussis
• Legionella pneumophila
• Streptococcus pyogenes
• Francisella tularensis
• Chlamydia trachomatis
• Cryptosporidium paarvum
• Giardia lamblia
• Entre otros

Las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFA) se basan en tener un colorante fluorescente conjugado a un anticuerpo secundario (anticuerpo antiinmunoglobulina). El antígeno se puede encontrar en la muestra fijada sobre la lámina portaobjeto sobre la cual se hace reaccionar un anticuerpo conocido dirigido a localizar los antígenos en la muestra. Después de realizar un lavado con el fin de remover el anticuerpo no fijado, se adiciona el conjugado formado por el anticuerpo antiinmunoglobulina y la fluoresceína, el que se une al anticuerpo primario (inmunoglobulina) si está presente. El complejo formado por el antígeno, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario conjugado, puede ser visualizado de la misma manera que en el método de inmunofluorescencia directa.

Entre las ventajas de la técnica indirecta se encuentran, su mayor sensibilidad, la posibilidad de utilizar el anticuerpo secundario conjugado para la detección de diferentes anticuerpos primarios y la probabilidad de poder cambiar la especificidad del anticuerpo secundario para detectar la clase de anticuerpo que está presente en una muestra. La desventaja es que su proceder técnico lleva varios pasos, los cuales la hacen un poco más larga que la prueba directa y al igual que esta, requiere personal técnico bien adiestrado.

Microscopio Electrónico

El microscopio electrónico ha hecho posible resolver el detalle celular a nivel molecular y ha permitido a los científicos poder observar las estructuras detalladas de las células procariótica y eucariótica. En el campo de la virología ha constituido un instrumento muy valioso, pues permitió la observación y la identificación de virus. Este microscopio usa una corriente de electrones en lugar de rayos luminosos para producir la imagen magnificada de un objeto, lo cual le confiere una mayor resolución, debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que los fotones de la luz blanca. Electrones acelerados en un campo eléctrico están asociados con longitudes de ondas cortas. Por ejemplo, electrones acelerados en un campo de 100 kV tienen longitudes de onda de aproximadamente 0,004 nm. Una explicación muy detallada de la microscopia electrónica escapa al alcance y objetivos de este capítulo, por lo que señalaremos algunos principios generales y su aplicación en la microbiología.

El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene muchas características en común con el microscopio luminoso. Fue el primero de los microscopios electrónicos y emplea un rayo de electrones, dirigido o enfocado por un lente condensador electromagnético sobre una muestra delgada. Al chocar los electrones con la muestra, se diseminan de manera diferencial, algunos pasan a través de la muestra y se reúnen y enfocan mediante lentes objetivos electromagnéticos que presentan una imagen de la muestra al sistema de lentes proyectores, para una amplificación posterior. La imagen se visualiza permitiendo que caiga en una pantalla que fluoresce cuando recibe el impacto de los electrones. Tiene un gran poder de resolución, permite la observación de partículas separadas por 0,001 m, con diámetros entre 0,001 y 0,2 m . En el microscopio electrónico de barrido (MEB), los electrones se enfocan mediante lentes en un punto muy fino y su interacción con la muestra libera diferentes tipos de radiaciones (electrones secundarios) de la superficie del material, que son capturadas por un detector, amplificadas y luego transformadas en imágenes en una pantalla de televisión. Este microscopio tiene un poder de resolución más bajo que el MET y resulta muy útil para la observación tridimensional de objetos microscópicos.

Técnicas

Las técnicas convencionales más usadas en la microscopia electrónica son:

• la tinción negativa
• la microtomía
• la congelación

La tinción negativa ha tenido amplia aplicación en el estudio de las macromoléculas, virus y organelas bacterianas. Los otros dos métodos ofrecen información sobre la morfología de las subunidades de las estructuras celulares y se han usado con éxito en el estudio de los antibióticos y su acción sobre las membranas de las bacterias y los hongos. Una técnica importante en la microscopia electrónica es el uso del “sombreado”, consistente en el depósito de una capa delgada de metal pesado sobre la muestra, la que se coloca en la vía del rayo de iones metálicos, en un vacío. Al obtener una impresión positiva de una imagen negativa, se logra un efecto tridimensional.

Autorradiografìa

Se trata de un procedimiento que tiene gran utilidad para el estudio de la replicación del ADN, que emplea timidina marcada con tritio como trazador específico en el seguimiento del proceso de replicación. El método se basa en fijar en una lámina portaobjeto, las células a las que se han incorporado átomos radiactivos, se cubren con emulsión fotográfica y se almacenan en la oscuridad por un período dado. En la película revelada aparecen huellas que emanan de los sitios de desintegración radiactiva. Si las células son marcadas con un emisor débil como el tritio, las huellas resultan lo suficientemente breves como para mostrar la posición del marcador radiactivo en la célula. Con el mismo principio del método se ha usado sondas de ácido nucleico marcado, conocido como hibridación in situ, y que resulta útil para detectar la presencia de ácido nucleico viral, bacteriano y micótico en células y tejidos.

Coloraciones

Un colorante biológico es una molécula que es capaz de unirse a una estructura de la célula y darle color. Los colorantes se emplean también en la constitución de los medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores. En microbiología, las coloraciones tienen diferentes objetivos: demostrar los microorganismos y algunas otras células en diferentes especímenes; poner de manifiesto algunas características morfológicas y estructuras microbianas tales como: esporas, flagelos, gránulos, cápsulas, etc., y diferenciar los microorganismos según su comportamiento tintorial. Los colorantes que se extraen de productos vegetales o animales se denominan colo- rantes naturales, entre los que se encuentran: el carmín, el tornasol, el índigo y la hematoxilina. Otros, como los extraídos del alquitrán de hulla, son anilinas sintéticas. En la actualidad, el término colorante de anilina se está abandonando porque muchos de los colorantes sintéti- cos en uso, no derivan de la anilina. Los ácidos y las bases libres son, en general, poco solubles, por lo que en microbiología se utilizan casi exclusivamente las sales de los ácidos y de las bases colorantes. Los llamados colorantes básicos contienen un catión coloreado unido a un anión incoloro y los ácidos constan de un catión incoloro unido a un anión coloreado. Los básicos son los más usados en bacteriología, debido a que las bacterias, ricas en ácidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos, los que se combinan con los colorantes cargados positivamente.

Entre los colorantes básicos, los más empleados son: tionina azul de toluidina, azul de metileno, fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo, safranina y verde de malaquita. Entre los ácidos podemos citar: naranja G, ácido pícrico, fucsina ácida y eosina. Los colorantes ácidos se utilizan en técnicas especiales, coloraciones negativas o en métodos para estudiar algunas estructuras bacterianas, fundamentalmente citoplasmáticas. Existe un grupo de sustancias, cuya base y ácido tienen carácter colorante, y son denominadas colorantes neutros. Entre ellos se encuentra el grupo de los eosinatos: eosinato de azul de metileno,de azul de toluidina de violeta de metilo.

Pasos para la coloraciòn

El primer paso de cualquier coloración es la preparación del frotis, el que puede realizarse a partir de las colonias, de cultivos en caldo y de las muestras o productos patológicos que se examinan. En la preparación de los frotis es necesario seguir el método establecido, cuyos pasos fundamentales consisten en extender el material sobre la lámina portaobjeto, secar al aire o con ligero calor y fijar con calor. Algunos frotis pueden fijarse con metanol, alcohol absoluto o cloroformo. El frotis debe ser preparado de manera tal que al realizar la observación microscópica, los microorganismos se encuentren con la separación adecuada que permita la óptima visualización de cada uno, lo que se logra al hacer una preparación cuidadosa, que no sea demasiado gruesa, evitando las masas de microorganismos.El objeto de toda coloración es fijar el colorante sobre la materia a teñir con una intensidad tal que un lavado con el solvente que sirvió para preparar el baño de tintura, no la decolore. Las soluciones colorantes que se emplean en bacteriología son, en general, acuosas. Cuando los microorganismos se tiñen por simple inmersión en el baño colorante, se denominan coloraciones directas, y cuando se tiñen tras la acción de un mordiente, se nombran coloraciones indirectas o por aplicación de un mordiente.Las coloraciones simples utilizan una sola sustancia colorante. En las coloraciones diferenciales, combinadas o compuestas se hacen actuar simultánea o sucesivamente varios colorantes con el fin de demostrar diferencias entre las estructuras de las células. En microbiología médica se usan con mucha frecuencia dos métodos de coloraciones compuestas o diferenciales, la coloración de Gram y la coloración de Ziehl-Neelsen.

Clasificaciòn de las coloraciones

COLORACIONES SIMPLES

Usan un solo colorante, no distinguen por lo tanto, organismos ni estructuras con reacciones tintoriales diferentes. Se emplean para la observación del tamaño, forma y agrupación de las células.El proceder consiste en dejar actuar, durante un tiempo, la solución colorante sobre el frotis. Los colorantes más empleados son: azul de metileno, fucsina diluida, tionina fenicada, azul de toluidina, safranina y cristal violeta.

COLORACIONES COMPUESTAS O DIFERENCIALES

Coloración de Gram

En 1884, Hans Christian Gram desarrolló un método de tinción bacteriana que coloreaba algunas células de color azul-violeta y otras que se decoloraban, se teñían con el color de la solución colorante empleada como contraste.En el procedimiento para la coloración de Gram se usan cuatro reactivos diferentes. El primero es una solución de cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina), que tiñe todas las células de color azul-violeta. El segundo reactivo es una solución de Lugol (yodo-yoduro de potasio). El yoduro remplaza al cloruro en la molécula de cristal violeta y el complejo formado se vuelve insoluble en agua. Todas las células reaccionan de igual forma. La adición de un tercer reactivo, decolorante (acetona y etanol), remueve solamente el colorante de las células gramnegativas. Con el fin de explicar esta manera de actuar se han planteado diversas causas, entre ellas, diferentes uniones al magnesio, a las ribonucleasas o al ácido nucleico. También se señalan diferencias en la permeabilidad, que sugiere que el alcohol decolora la membrana externa de las bacterias gramnegativas, las cuales permiten la salida del complejo cristal violeta-Lugol.La safranina, colorante de contraste y cuarto reactivo empleado en el método, hace visible las células gramnegativas al teñirlas de color rojo. Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base de la reacción diferencial frente a la coloración de Gram. Las bacterias teñidas de azul-violeta, llamadas grampositivas, poseen grandes cantidades de ácido teicoico en sus paredes celulares; y las teñidas en rojo, bacterias gramnegativas, contienen lipopolisacáridos. Se han descrito diferentes modificaciones al método original de Gram, entre las que podemos citar:La modificación de Hucker, que recomienda la utilización de una solución de cristal violeta en lugar de la violeta genciana empleada por Gram. Otra modificación es la que emplea carbolfucsina como colorante de contraste y se recomienda para el estudio de bacilos anaerobios gramnegativos y de las especies del géne- ro Legionella. La modificación de Kopeloff se recomienda para una mejor visualización de las bacterias anaerobias y consiste en adicionar a la solución de cristal violeta, colocada sobre el frotis, unas gotas de una disolución de NaHCO3 al 5 %.

Coloracion Microorganismos Acidoresistentes

Las especies del género Mycobacterium, las nocardias, algunos actinomicetos y los criptosporidios, retienen los colorantes aun después de los procesos de decoloración con ácidos, o con soluciones de ácido-alcohol o ácido-acetona, por lo que son denominados microorganismos acidorresistentes.Dicho carácter es atribuido a un componente lipídico (ácido micólico) en las paredes bacterianas de las especies del género Mycobacterium y otros organismos relacionados. En el caso de los criptosporidios y de las endosporas se le atribuye a factores de impermeabilidad. Los componentes y factores antes mencionados hacen más difícil la penetración del colorante en la célula microbiana, por lo que los procederes para estas coloraciones necesitan de la ayuda del calor, de solventes orgánicos o de detergentes. Entre los métodos de coloración para demostrar la acidorresistencia se encuentran el método de Ziehl-Neelsen, el de Kinyoun y el que utiliza colorantes de fluorocromo; en este último es necesaria la observación en un microscopio de fluorescencia.La coloración de Ziehl-Neelsen es una modificación de un método descrito por Paul Ehrlich en 1882 y consiste en cubrir el frotis con una solución de carbolfucsina que se calienta hasta que emita vapores, se decolora con alcoholácido (ácido clorhídrico al 3 % en Microscopía y coloraciones2 5 etanol) y finalmente se aplica un colorante de contraste, azul o verde (azul de metileno de Löffler o verde de malaquita). Los microorganismos que retienen el color rojo del primer colorante son los acidorresistentes y los que no los retienen, son los no acidorresistentes, y toman el color del colorante de contraste. La coloración de Kinyoun no requiere la aplicación del calor y utiliza colorantes simila- res al método de Ziehl-Neelsen. El método que aplica rodamina-auramina no utiliza el calor y emplea como colorante de contraste una solución de permanganato de potasio o de naranja de acridina.

Coloraciones Negativas

Son coloraciones que se emplean fundamentalmente para la observación de estructuras bacterianas que se tiñen con dificultad con otros métodos.Se fundamenta en hacer resaltar las células sin teñir, sobre un fondo teñido; para lograrlo se utiliza tinta china o colorantes ácidos (ejemplo: la nigrosina).

Coloraciones Para Demostrar Estructuras de los Microorganismos

Coloración de cápsulas

Los métodos más usados para poner de manifiesto las cápsulas bacterianas son las coloraciones negativas o sus modificaciones. Un método de tinción de la cápsula es el que trata las bacterias con una solución caliente de cristal violeta seguido por un lavado con solución de sulfato de cobre, con el fin de remover el exceso de colorante, ya que el lavado con agua disolvería la cápsula. El sulfato de cobre también imparte color al fondo. A la observación microscópica, la célula y el fondo aparecen teñidos en color azul oscuro y la cápsula de color azul pálido. La coloración de Anthony-Hiss emplea las mismas soluciones colorantes antes descri- tas, pero en el momento de realizar el frotis, los microorganismos se suspenden en un líquido proteico (leche, suero). Después de la aplicación de los colorantes, el cristal violeta se fija a la proteína y destaca la cápsula de la célula; el sulfato de cobre tiñe la cápsula.

Coloración de flagelos

Cuando los flagelos se tratan con suspensiones coloidales inestables de sales de ácido tánico, pueden ponerse de manifiesto y conocerse su disposición en la célula. El fundamento del método está dado por la formación de un grueso precipitado que se deposita sobre la pared celular y los flagelos, aumentando el diámetro de los mismos, de manera tal que al aplicar fucsina básica se hacen visibles en el microspio óptico (coloración de Leifson). El método de Leifson fue modificado por Ryu y utiliza el cristal violeta en lugar de la fucsina, que hace más estables los reactivos a la temperatura ambiente. Otro método para la coloración de estas estructuras es la coloración con plata, que emplea, entre otras, una solución de nitrato de plata y aplicación de calor. Los flagelos se visualizan al microscopio como líneas oscuras. En los casos de bacterias con muchos flagelos, se pueden agrupar en haces durante el movimiento y es posible observarlos al estudiar la célula viva mediante la microscopia de campo oscuro o de contraste de fases.

Coloración de esporas

En observaciones microscópicas de preparaciones de bacterias sin teñir, las esporas se observan como cuerpos refringentes intracelulares y si las células bacterianas están teñidas con los métodos habituales, se aprecian como zonas incoloras en su interior.Para la tinción de las esporas, habitualmente se utiliza el carbolfucsina o el verde de malaquita. El primero, en el método de Ziehl-Neelsen ya descrito, y el segundo, en el método de SchaefferFulton. En el método de Moeller se aplican los mismos colorantes que en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, pero se fija el frotis con alcohol absoluto y cloroformo. Por la impermeabilidad de la pared de la espora se requiere calentar la preparación con el fin de que el colorante penetre. Al emplear suficiente cantidad de alcohol que permita la decoloración de la célula vegetativa, la impermeabilidad de la pared no permite la decoloración de la espora.En los métodos de tinción de las esporas antes señalados, se utilizan colorantes de contraste para la célula vegetativa. Cuando teñimos la espora con verde de malaquita, utili- zamos safranina como colorante de contraste; y cuando la espora se tiñe con carbolfucsina, la célula vegetativa se tiñe con azul de metileno.

Coloraciones de gránulos metacromáticos

Los gránulos de volutina en el interior del citoplasma bacteriano, constituyen una fuen- te de adenosina trifosfato (ATP) y tienen la característica de ser gránulos metacromáticos, o sea, que aparecen teñidos de diferente color al resto de la célula. Se tiñen intensamente con los colorantes de anilina.Se han descrito diferentes métodos de coloración para ponerlos de manifiesto, entre ellos: la coloración de Albert, la modificación de Christensen, la coloración de Neisser y las coloraciones de azul de metileno para gránulos y bacterias, así como la coloración con azul de metileno alcalino.

Coloración de núcleo

Los núcleos se pueden teñir con los colorantes específicos para ADN. Ejemplo: coloración de Feulgen.

Fuente

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