Sistema de inmersión temporal

Sistema de Inmersión Temporal Concepto: Sistema de cultivo semiautomatizado para la propagación in vitro de plantas.

Sistemas de Inmersión Temporal (SIT). Sistema de cultivo semiautomatizado para la propagación in vitro de plantas. Está basado en el contacto intermitente del medio de cultivo líquido con los explantes por un corto período de tiempo y la consecuente renovación de la atmósfera gaseosa, para evitar la hiperhidricidad de los tejidos y la acumulación de gases tóxicos.

Antecedentes

Existe gran cantidad de empresas en el mundo dedicadas a la micropropagación comercial; algunas de ellas producen más de 200000 plantas in vitro por semana, de especies ornamentales, frutales, forestales, raíces y tubérculos. Tradicionalmente, la producción de vitroplantas en estos laboratorios emplea un medio de cultivo semisólido, con bajas densidades de siembra y con limitaciones de producción, debido a los requerimientos de espacio y al empleo de gran cantidad de mano de obra, lo cual incrementa los costos y trae como consecuencia una menor eficiencia económica (Preil et al., 1988).
El empleo de medios líquidos es primordial para lograr la automatización de los procesos de cultivo in vitro. Sin embargo, el contacto constante de los explantes con el medio de cultivo líquido puede producir vitrificación. Al respecto, para reducir o eliminar este problema se proponen sistemas donde el explante está en contacto intermitente con el medio líquido y se produce una renovación continua de la atmósfera del envase para evitar acumulación de gases tóxicos como el etileno. Para resolver estos problemas se desarrollaron los recipientes para la inmersión temporal, los cuales son sistemas de cultivo que se basan en el contacto intermitente del medio líquido con los explantes por un corto periodo de tiempo.
Mediante el uso de este sistema de micropropagación se puede incrementar considerablemente el coeficiente de multiplicación de brotes en comparación con las formas convencionales de propagación.

Importancia

Permite airear los tejidos de los brotes unido al contacto completo de los mismos lo que facilita una mayor incorporación y asimilación de los nutrientes por los tejidos y como consecuencia aumenta el coeficiente de multiplicación y la calidad de los brotes.
Estos sistemas alternativos con el empleo de medio de cultivo líquido se han desarrollado con el propósito de automatizar, al menos las fases que requieran mayor manipulación del proceso in vitro y con ello, la consiguiente reducción de los costos de producción.
Los SIT pueden ser utilizados para la producción de brotes vía organogénesis a escala masiva, brindando la posibilidad de automatizar algunas etapas del proceso de micropropagación. Además, ofrecen mayor facilidad de escalado, con la finalidad de producir grandes volúmenes de plantas.

Componentes

Está formado por dos frascos de cultivo, uno para el crecimiento de los explantes y el otro como reservorio de medio de cultivo. Estos frascos son conectados entre sí por una manguera de silicona mediante conectores que atraviesan la tapa. En la parte interna de la misma se coloca una manguera menos flexible, la cual desciende hasta el fondo en ambos recipientes. El medio de cultivo circula de un frasco a otro en dependencia de la apertura o cierre de las electroválvulas, las cuales están conectadas a un temporizador programable para la determinación de la frecuencia y la duración de la inmersión. A la entrada de los frascos se colocan filtros hidrofóbicos (0,22 µm, Midisart 2000, Sartorius AG) para garantizar la esterilidad. La presión de aire proveniente de un compresor y es regulada por un manómetro.

Tipos de Sistemas de Inmersión Temporal

Se han utilizado con éxito varios SIT diferentes en los últimos años para la micropropagación de una variedad de especies de plantas de valor agrícola, medicinal y de conservación. Algunos están patentados y otros son el resultado del ingenio de los investigadores que pueden no tener los fondos para comprarlos.

Modelos de SIT disponibles comercialmente. De izquierda a derecha Rita®, Plant Form y SETIS^TM

Sistema Twin-Flask

Los sistema Twin-Flask (BIT^®) (Escalona et al., 1999) estan integrado por un contenedor para plantas en crecimiento y un reservorio para el medio líquido. Cuando se abre una válvula solenoide y se gira el aire comprimido el medio de cultivo es forzado en el primer matraz, sumergiendo las plantas. El proceso se invierte cuando se abre otra válvula solenoide y la presión del aire regresa el medio de cultivo al depósito original.

Sistema RITA^®

El sistema RITA^® (Recipiente de inmersión temporal automatizada) (Alvard et al., 1993) está compuesto por un frasco único donde el compartimento superior contiene los explantes y el compartimento inferior contiene el medio de cultivo líquido. Están unidos entre sí, de modo que cuando se aplica una sobrepresión en el compartimiento inferior, el medio se empuja al superior; cuando la sobrepresión cae, el medio líquido regresa al compartimiento inferior. En consecuencia, los cultivos en el compartimiento superior se sumergen temporalmente cuando el compartimiento superior se inunda con el medio líquido, cuya frecuencia y período de tiempo pueden regularse.

Esquema del funcionamiento del sistema RITA^®

Frascos Nalgene^®

Se aplicó este principio a un sistema de filtración de polisulfona Nalgene^®, (Stanly et al. 2010) reutilizable al conectar cada uno de los dos compartimentos con un tubo equipado con un filtro de 22 µm, a través del cual se aplica presión para impulsar el medio cultivo al compartimento superior que alberga los explantes. La salida en la parte superior del recipiente permite que escape la presión y el aire que entra al recipiente se filtra a través de un filtro de jeringa estéril.

Plant form

Es fabricado en policarbonato transparente con el tamaño de 180x160x150 mm. Una cesta con orificios de 1 mm de tamaño se coloca sobre una cámara que controla el flujo del medio. Esta cesta sostiene el material vegetal. Un marco con cuatro patas se coloca sobre la canasta para evitar que la canasta suba cuando se aplica presión de aire al biorreactor. La construcción y la colocación de la cesta se realizan de manera que las plantas solo se sumergen en el medio líquido cuando se aplica presión de aire al biorreactor. Además, el biorreactor tiene tres orificios para suministro de medio, aireación y ventilación. Los tornillos huecos especialmente diseñados provistos de sellos de silicona están ajustados firmemente dentro de los orificios. Conectados a estos tornillos están los tubos flexibles de plástico Tygon, con un diámetro interno de 3,2 mm, y filtros de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,22 µm.

SETIS^TM

Este sistema consta de dos recipientes horizontales acoplados uno sobre el otro con una capacidad de 3 L. Cada uno presenta una abertura de 80 mm con empaques de silicón y tapas de rosca, se conectan entre sí por una manguera en la parte inferior del recipiente. En sus extremos superiores, un orificio conectado a un filtro permite la entrada de aire estéril.

Sistema de Inmersión Temporal Tipo SETIS^TM

Ventajas de los SIT

• El contacto directo con el medio de cultivo renovado durante cada inmersión garantiza una forma más eficiente de suministro de los nutrientes en comparación con la forma estática en que se toman los mismos en el cultivo convencional (semisólido o líquido).

• Los tiempos de inmersión son cortos, la mayoría del tiempo los explantes están solamente recubiertos de una película de medio de cultivo líquido y de esta forma se evita la desecación de los mismos.

• La resistencia a la difusión de gases es baja y existe una mínima ruptura del intercambio gaseoso entre los tejidos y la atmósfera, por tal razón dentro del vaso de cultivo se renueva en intervalos regulares de tiempo.

• La agitación por el flujo de aire durante la fase de inmersión causa expansión de los tejidos y se facilita un mayor contacto de estos con el medio de cultivo.

• Mayor optimización biológica por los altos coeficientes de multiplicación que se obtienen.
• Reducción importante de los costos por vitroplantas.

• Reducción del número de frascos y estantes en las cámaras de cultivo y por tanto mayor producción por metro cuadrado de cámara.

• Eliminación de la fase de enraizamiento in vitro.

• Mejor comportamiento de las vitroplantas ex vitro por mayor metabolismo autotrófico durante la fase in vitro.

Resultados obtenidos en los SIT

Han sido utilizado exitosamente en diferentes especies de plantas cultivadas, entre ellas: plátanos, bananos, cítricos, café, piña, papa, malanga, yuca, ñame, papaya, boniato etc.; respecto a las distintas técnicas de cultivo de tejidos como proliferación de meristemos, desarrollo de embriones a partir de callos, germinación y conversión de embriones somáticos a planta, etc. En el Sistema de Inmersión Temporal se logra un aumento de la eficiencia biológica y productiva del material propagado; debido entre otros aspectos al incremento de los coeficientes de multiplicación y la obtención de plantas de mayor calidad en comparación con el empleo del medio de cultivo en estado líquido o semisólido, así como la reducción de los costos de producción producidos en estos sistemas con respecto a los métodos convencionales. Entre las líneas de trabajo del Laboratorio de Biotecnología Vegetal del INIVIT se encuentra la automatización de la micropropagación en SIT y en particular en el cultivo de plátanos y bananos se han obtenido resultados significativos en los cultivares 'FHIA 21' (AAAB), 'INIVIT PV 06-30' (AAB) y FHIA-25 (AAA).

Automatización de la micropropagación

La automatización del proceso de propagación in vitro es una necesidad para la reducción de los costos en la industria de la micropropagación. El uso de medios de cultivos líquidos es un aspecto primordial para la automatización de la propagación in vitro. Además, es considerada como la técnica ideal para la propagación masiva de plantas, ya que disminuye la manipulación y permite reducir los costos del medio de cultivo. Su principal desventaja radica en el efecto negativo que provoca sobre los tejidos de los brotes, bien sea por hiperhidricidad o hipoxia. El desorden fisiológico es eliminado o minimizado mediante la agitación del medio de cultivo líquido o sistemas de cultivo que permiten la aireación parcial o continúa del medio de cultivo. Para la micropropagación de plátanos y bananos se han empleado los medios de cultivo en estado líquido, aunque el estado semisólido ha sido el mayormente empleado.

Empleo de medios líquidos

Ventajas y desventaja

Sus ventajas incluyen la facilidad de preparación, esterilización y manipulación, mayor rapidez en la absorción de sustancias nutritivas y la difusión de sustancias tóxicas producidas por el metabolismo de las plantas. Además, el cambio en la composición del medio puede efectuarse por simple transferencia, brinda grandes posibilidades para la automatización y la reducción de los costos por producción. Sin embargo, en condiciones estáticas provoca un efecto depresivo sobre el crecimiento del tejido en el cultivo in vitro, ya sea por hipoxia o por hiperhidricidad. Para evitar este problema se han diseñado nuevos tipos de biorreactores y sistemas semiautomatizados de cultivo líquido basados en la inmersión parcial y temporal de los explantes.

Plátanos y bananos

Han alcanzado mayor importancia como cultivo comercial y de subsistencia en regiones lejanas de su centro de origen primario; específicamente en los países del trópico y subtrópico, ya que se han convertido en el principal producto para la alimentación de los habitantes y de centenares de millones de personas en países en desarrollo. En la alimentación, son fuente importante de carbohidratos (35%), proteínas (1,2%) y fibras (6-7%); adicionalmente aportan potasio, magnesio, fósforo, calcio y vitamina A y C. Es considerado una buena fuente de vitaminas A, B1, B2 y C, por el alto contenido de Vitamina B6 Se clasifican en diploides, triploides y tetraploides. Los tetraploides son clones de altos rendimientos que presentan racimos con un elevado número de manos y frutos y son tolerantes a las principales plagas y enfermedades que afectan a este cultivo. Motivado por la alta productividad de los mismos, en muchas zonas de nuestro país se han sustituido los plátanos triploides por este material, con una buena aceptación por parte de la población cubana.

‘FHIA 21’ (AAAB)

Sistema de Inmersión Temporal en 'FHIA-21'

El 'FHIA 21' es un cultivar tetraploide ya que el conteo cromosómico de las células presenta 2n=44 cromosomas. El grupo genómico del clon donante de 'FHIA 21' es AAAB, por lo que a partir de los tamaños diferenciales de los cromosomas de los grupos genómicos A y B pudiera explicarse la pérdida de un juego de cromosomas y la reversión del nivel de ploidía al ser sometido a las condiciones del cultivo in vitro. El tipo de raquis presente tiene una forma intermedia de la yema masculina, el ápice de las brácteas ligeramente puntiagudo, lobos de color amarillo verdoso sin signos visibles de pigmentación, resultados estos que reafirman sus relaciones fitogenéticas, así como su ubicación dentro de los híbridos tetraploides. Con la aplicación del SIT se establece una tecnología para la propagación in vitro en el cultivo del plátano vianda ‘FHIA 21’ (AAAB) más eficiente que la micropropagación convencional donde se obtiene un coeficiente de multiplicación de 17,53 con el medio MS suplementado con 2,0 mgL^-1 6-BAP; 0,65 mgL^-1 AIA y 1,0 mgL^-1 de paclobutrazol en 18 días de cultivo en condiciones de oscuridad.

‘INIVIT PV 06-30’ (AAB)

En este cultivar de plátano vianda se obtienen resultados muy elevados con la utilización del SIT donde se alcanza un coeficiente de multiplicación de 16,61 con el medio MS suplementado con 2,25 mgL^-1 6-BAP; 0,65 mgL^-1 AIA en 18 días de cultivo.

‘FHIA-25’ (AAA)

En este cultivar de banano se han obtenido coeficientes de multiplicación de 13,21 con la utilización del medio de cultivo de cultivo MS suplementado con 2,25 mgL^-1 6-BAP; 0,65 mgL^-1 AIA en 18 días de cultivo.

Sistema de Inmersión Temporal en 'INIVIT PV 2011'

‘INIVIT PV 2011’

El uso de Sistemas de Inmersión Temporal tipo RITA^®, permitió aumentar el coeficiente de multiplicación de 2.6 a 5.8 con una densidad de 30 explantes por frasco con un tiempo de subcultivo cada 10 días. Todo esto debido a la competencia entre los explantes por el espacio, o por las condiciones de oxigenación en estos sistemas. Además, con el empleo de estos sistemas es posible aumentar el coeficiente de multiplicación en relación con el medio de cultivo de multiplicación estático: semisólido y líquido.

El VIUSID Agro® una alternativa para la producción de explantes de plátano en sistema de inmersión tipo RITA® temporal TIPO RITA®

Sistema de Inmersión Temporal, tipo RITA^® con VIUSID agro^®

Plantas producidas in vitro con 1.0 ml. L^-1 de VIUSID agro^® en sistema de inmersión temporal, tipo RITA^® a los 15 días de cultivo en el cultivar de banano ‘Cavendish gigante’

Muchos productos naturales han sido empleados para potenciar el manejo ecológico de los agroecosistemas e incrementar las producciones, entre los que se encuentran bioplaguicidas, biofertilizantes, biorreguladores y bioestimulantes.

En los últimos años y especialmente en Cuba, son muchos los bioestimulantes y biofertilizantes orgánicos que permiten a las plantas superar las situaciones de estrés en las condiciones adversas del medio. Un producto con estas características promotor del crecimiento es el VIUSID Agro^® que hace posible que se favorezca la fase vegetativa de los cultivos aumentando la longitud de los tallos, así como el número de brotes, número de hojas y el área foliar. El VIUSID Agro^® también es un regulador del crecimiento vegetal que estimula y promueve el desarrollo de las plantas. Es un producto que contiene esencialmente aminoácidos, vitaminas y minerales.

Durante la etapa de multiplicación in vitro al adicionar al medio de cultivo 1,0 ml.L^-1 de VIUSID Agro^®, se logró incrementar el coeficiente de multiplicación de 2,2 (control) a 4,51, con un tiempo de subcultivo de 15 días en el cultivar de banano “Cavendish gigante”.

Biorreactores

Los biorreactores empleados en la fermentación microbiana han sido modificados para el cultivo in vitro de plantas y utilizados en el escalado de la propagación vía organogénica o embriogénica; ya que tienen la posibilidad de producir grandes volúmenes de plantas bajo un sistema computarizado que permite definir los requerimientos para el desarrollo de las células y la regeneración de plantas de una forma más precisa que las técnicas convencionales in vitro.

El uso de biorreactores, es idóneo para eliminar los efectos de hiperhidricidad debido que es posible monitorear y controlar no sólo el sistema de aireación, sino también otros parámetros ambientales del cultivo in vitro (temperatura, velocidad del agitador, pH, etc.). Se ha empleado con éxito en la micropropagación de gladiolos (Gladiolus nanus cv. Ronit y Eurovision), helecho (Nephrolepis exaltata schoot cv. Bostoniensis), papa (Solanum tuberosum var. Desirré) y bananos (cv. Williams, AAA y Gran Enano, AAA); utilizando retardantes del crecimiento, que estimulan el desarrollo de clusters durante los estados de proliferación, y con ello reducen el crecimiento y desarrollo de tallos y hojas evitando la hiperhidricidad de los mismos.

Para la propagación masiva de plantas, los biorreactores facilitan la automatización y escalado de la producción, lo que permite reducir los costos por planta. Sin embargo, estos beneficios deben ser balanceados con las dificultades que implica esta tecnología para la propagación comercial, principalmente el alto costo de la inversión y mantenimiento del equipo, así como también las dificultades de la aclimatización de las plantas al ambiente ex vitro. Razón por la cual otros sistemas se han desarrollado con la finalidad de disminuir los costos de producción, sin incurrir en grandes inversiones en equipos sofisticados.

Fuentes

• Basail, M. (2005). Multiplicación en Sistema de Inmersión Temporal del cultivar híbrido ‘FHIA 21’ (AAAB). Tesis para optar por el Grado Científico de Master en Biotecnología Vegetal. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Santa Clara.
• Basail, M. (2011). Empleo del Sistema de Inmersión Temporal para la multiplicación del clon de plátano vianda 'INIVIT PV 06-30' (AAB) y su generalización en las biofábricas. (http:///bva.fao.cu).
• Basail M, Medero V, Otero E, Torres M, Cabrera M, López J, Santos A, Rayas A, Bauta M, Páz E, Beovidez Y, Ortega A, Enrique J. (2011). Multiplicación in vitro de ‘FHIA-25’ (Musa spp., AAB) en Sistemas de Inmersión Temporal. Revista Biotecnología Vegetal 11(1): 27-31.
• Basail M, Medero V, Robaina A, Rubio A, Torres. Y, Santos A, Rayas A, Rodríguez D, Beovides Y, Gutiérrez Y. (2019). Aplicación de VIUSID Agro® en la propagación in vitro del cultivar de banano ´Cavendish enano´ en Sistema de Inmersión Temporal tipo RITA®. Evento de Catalisys 2019, Habana, 26-28 de noviembre