Southern blot
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Southern blot. Técnica analítica utilizada en biología molecular para detectar o identificar ADN de interés a partir de una muestra compleja de ADN. Es también conocida como hibridación Southern o simplemente Southern, debido al nombre de su inventor, Edwin Southern, destacado biólogo molecular inglés. Como procedimiento de laboratorio, el Southern blot se puede utilizar para analizar el ADN total de un organismo, también conocido como su genoma, con el fin de identificar una secuencia específica de interés.
Sumario
Antecedentes
La capacidad de las cadenas de ADN para hibridar proviene de su naturaleza complementaria claramente representada en el modelo de estructura de ADN de Watson-Crick. En un principio se llevaron a cabo experimentos para estudiar la capacidad de renaturalización del ADN y la formación de híbridos de ADN / ARN para comprender la expresión en tejidos o células específicas. A partir de entonces, la hibridación entró en escena con el desarrollo de sondas que pueden detectar secuencias específicas dentro de la diana y la inmovilización de las secuencias diana sobre un soporte sólido como polvo de nitrocelulosa que luego dio lugar a membranas de nitrocelulosa. La demostración de Southern de que los fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel se pueden transferir a una membrana, permitió la caracterización del ADN por patrones de hibridación y por tamaños moleculares.
Principio
El proceso implica la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana portadora que normalmente es nitrocelulosa y la posterior detección del fragmento de ADN diana mediante la hibridación de la sonda. La hibridación se refiere al proceso de formación de una molécula de ADN bicatenario entre una sonda de ADN monocatenario y un ADN diana monocatenario. Dado que la sonda y el ADN diana son complementarios entre sí, la reacción es específica, lo que ayuda a detectar el fragmento de ADN específico.
Procedimiento
1. Extracción y purificación del ADN. Se realiza la purificación del ADN de interés según los procedimientos estándar de aislamiento o utilizando kits comerciales que permiten la extracción de fuentes variadas como células de mamíferos, plantas, bacterias, hongos.
2. Digestión del ADN con endonucleasas de restricción. El ADN extraído de la muestra se trata con endonucleasas de restricción, enzimas que cortan las hebras de ADN de alto peso molecular en fragmentos más pequeños. Se pueden usar una o más enzimas de restricción.
3. Electroforesis en gel de agarosa. Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante el proceso, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas más pequeñas se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño.
4. Desnaturalización. Los fragmentos de ADN ya separados son bicatenarios por naturaleza por lo que son tratados con una solución alcalina para desnaturalizarlos, mientras permanecen en el gel de agarosa. Tras la neutralización de esta, se obtienen los fragmentos de ADN monocatenario adecuados para la hibridación con la sonda.
5. Transferencia. Los fragmentos desnaturalizados se transfieren luego a una membrana de filtro de nailon o nitrocelulosa, lo que se hace colocando el gel sobre un papel de filtro saturado con tampón y luego colocando la membrana de filtro de nitrocelulosa en la parte superior del gel. Finalmente, se colocan unos papeles de filtro secos encima de la membrana. Los fragmentos son empujados hacia la membrana del filtro de nitrocelulosa por acción capilar y dan como resultado la impresión de contacto del gel.
6. Hibridación. A continuación, la membrana se expone a una sonda de hibridación que es un fragmento de ADN con una secuencia específica cuya presencia en el ADN diana se va a determinar. El ADN de la sonda se marca para que pueda detectarse, normalmente incorporando radiactividad o marcando la molécula con un tinte fluorescente o cromogénico.
7. Lavado. Después de la hibridación, la membrana se lava a fondo con un tampón para eliminar la sonda que está unida de forma inespecífica o cualquier sonda no unida que esté presente.
8. Autorradiografía. Las regiones hibridadas se detectan colocando la membrana de nitrocelulosa en contacto con una película fotográfica que muestra las moléculas de ADN hibridadas. El patrón de hibridación se visualiza en una película de rayos X por autorradiografía en el caso de que se use una sonda radiactiva o fluorescente o por el desarrollo de color en la membrana si se usa un método de detección cromogénico.
Aplicaciones
- Identificación de ADN específico en una muestra de ADN
- Preparación de mapas RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción)
- Detección de mutaciones, deleciones o reordenamientos de genes
- Determinación de identidad en medicina legal y análisis de huellas genéticas (VNTR o minisatélites)
- Detección e identificación de genes en individuos transgénicos
- Mapeo de sitios de restricción
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas
- Pronóstico del cáncer y diagnóstico prenatal de enfermedades genéticas
- Determinación del peso molecular de un fragmento de restricción y medida de cantidades relativas en diferentes muestras
Comparación entre Southern blot, PCR y cromatografía
En la mayoría de las aplicaciones, la tecnología de PCR ha reemplazado a la técnica de Southern blot. Sin embargo, la tecnología de PCR depende de la información precisa de la secuencia de ADN para el diseño de cebadores específicos y el Southern blot es independiente de tal requisito. Además, en la PCR, si el diseño de los cebadores falla teniendo en cuenta el reordenamiento del gen que se está analizando, el Southern blot siempre proporcionará información. En comparación con la cromatografía, la ventaja del Southern blot es que amplifica los niveles límite de detección que son necesarios o útiles para investigar loci genómicos particulares. No obstante, este método se enfrenta a inconvenientes tales como el requisito de una alta concentración inicial de ADN diana.
