Heterorhabditis bacteriophora

Heterorhabditis bacteriophora Taxonomía Nombre científico ' Reino: Animalia Filo: ' Clase: Adenophorea (Aphasmida) Orden: Rabditida Familia: Heterorhabdidae

Heterorhabditis bacteriophora. El uso de nematodos entomopatógenos en la lucha biológica aplicada contra plagas cobra auge significativo en gran parte del mundo. A estos organismos se les atribuyen ciertas características que superan las bondades de los medios microbiológicos usados tradicionalmente para combatir plagas. En nuestro país, es aún incipiente el trabajo en esta especialidad, a pesar de que se han hecho esfuerzos para su introducción en el Manejo Integrado de algunos cultivos como cítrico, arroz y boniato.

Se requiere pues, de un impulso sostenido en este sentido, para el desarrollo de tecnologías que permitan su rápida generalización y puesta en práctica en el combate de plagas fundamentales de cultivos económicos, como una alternativa más en los Sistemas de Manejo Integrados de la Producción Agrícola

A diferencia de otros patógenos de insectos los nematodos tienen un origen más reciente y su desarrollo como una especialidad dentro de la patología de insectos se remonta a poco más de una década.

Las características más importantes que han contribuido a una mayor atención sobre estos agentes son su gran capacidad de adaptación a nuevos ambientes y a condiciones adversas, su resistencia a los agentes químicos y su especificidad por los insectos, lo que se asocia a su inocuidad al hombre y otros mamíferos, a todo esto se suma su efecto sinérgico al poder actuar conjuntamente con otros organismos entomopatógenos. Pueden actuar conjuntamente con otros organismos entomopatogenos.

Los nematodos entomopatógenos están capacitados para buscar y matar rápidamente a los hospedantes ya que tienen una alta virulencia y elevada tasa de reproducción, además de resultar seguros para organismos No blanco.

Según Poinar en 1979, los nematodos parásitos de insectos se agrupan en 6 familias. Dentro de éstas las más importantes son: Steinernematidae y Heterorhabditidae y dentro de ellas los géneros Steinernema y Heterorhabditis, endoparásitos de la cavidad abdominal, que son los que presentan las mejores posibilidades de reproducción y una probada efectividad en campo. Es entonces a partir de ellos que se obtienen la mayoría de los productos comerciales. La producción "in vivo" es la más adecuada para pequeñas cantidades. El primer método sobre insectos vivos, fue descrito por Glaser para lo cual las larvas más utilizadas son las de Galleria mellonella. Ahora bien, actualmente la tecnología de obtención de nematodos por fermentadores es la más novedosa y productiva y se esta desarrollando en numerosos países, a pesar de algunos inconvenientes como son los problemas para la explotación y diseño de los fermentadores. En 1972 Werser planteó que el método más sencillo era el utilizado por Dulki, el cual consiste en colocar larvas muertas por el nematodo en trampas de agua, lo que permite que en 3 ó 4 días se puedan obtener entre 60,000 - 80,000 nemátodos por larva.

En Cuba se producen en biolaboratorios y se optimizan las técnicas de reproducción de las crías de hospedantes alternativos como Corcyra cephalonica y Heliothis heliothidis en este último insecto se obtienen entre 25,000 y 30,000 nematodos por larva y aunque la productividad es baja, con relación al uso de G. mellonella se puede usar como una alternativa. Uno de los aspectos más importantes para la producción masiva de los nematodos es su formulación. Estos deben ser inmovilizados para prevenir el consumo de sus reservas y por tanto su deterioro. La inmovilización se realiza manteniéndolos a bajas temperaturas en suspensión acuosa (15oC) pero esta no es comercialmente ventajosa. Actualmente se usan geles de poliacrilamida, y alginatos o desecados parcialmente sobre arcillas. Una posible solución se busca en las técnicas de la Ingeniería Genética tratando de inducir a los nematodos a un estado anhidrobiótico que permita su formulación como polvo seco.

Características.

Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema constituyen una opción favorable en el control biológico de insectos plagas. Dentro de sus características se destaca el hecho de poseer un amplio rango de hospedantes, matar rápidamente al hospedante, poseer estadios infectivos duraderos que permiten su distribución, almacenamiento y persistencia, contándose en la actualidad con tecnologías de reproducción masiva relativamente baratas. Los miembros de esta familia son parásitos obligados y patógenos de insectos y se diferencian de otros grupos en: Asociación simbiótica con bacterias del género Xenorhabdus y Photorhabdus Amplio espectro de hospedantes Pueden ser cultivados "in vivo" o "in vitro" a gran escala en medios artificiales líquidos o sólidos. Los estadios infectivos pueden ser almacenados por largos periodos de tiempo.

El mecanismo de acción de los nematodos entomopatógenos se basa en la simbiosis que desarrollan con bacterias asociadas pertenecientes a los géneros Photorhabdus y Xenorhabdus respectivamente. Las bacterias del género Xenorhabdus son Gram negativas, flageladas y anaerobias facultativas. Se ha reconocido una especie bioluminiscente asociada a Heterorhabditidos (X. luminiscence). Como resultado de su metabolismo, estas bacterias producen antibióticos que impiden la proliferación de otros organismos y por tanto preservan los tejidos semi descompuestos del huésped, los que son aprovechados por los nematodos para su alimentación y multiplicación especialmente durante la reproducción.

Ciclo de vida

Como la mayoría de los nematodos de esta familia posee un ciclo de vida simple que incluye el huevo y 4 estadios. Juveniles, separados por mudas. Huevo, L1 primera muda, L2 segunda muda, L3 (infectivo) tercera muda L4, cuarta muda (adulto). El L3 siendo el tercero o dauer (termino que proviene del idioma alemán y que significa perdurable), es el único capaz de sobrevivir fuera del hospedante, además de poseer en su interior la bacteria simbiótica la cual transporta de un insecto a otro.

Los juveniles infectivos penetran al hospedante por vía oral, anal, espiráculos o tráquea, en el caso de Heterorhabditis también a través del tegumento intersegmental, se dirigen al hemocele donde se liberan las bacterias, las cuales se multiplican y causan la muerte del insecto al provocar una septicemia en 24-96 horas. Estas bacterias producen antibióticos que impiden la proliferación de otros organismos y por tanto preservan los tejidos semi descompuestos del huésped, los que son aprovechados por los nematodos para su alimentación y multiplicación.

Los nematodos continúan su desarrollo (muda) y llegan al estado y posteriormente pasan a adultos. En el mismo hemocele copulan y dan lugar a una nueva progenie, que si las condiciones son favorables el juvenil L3, infectivo sale del insecto y busca un nuevo hospedante.

La bacteria asociada cuando se libera en la hemolinfa puede, producto de su metabolismo, producir sustancias alimenticias que son asimiladas por los nematodos. La muerte del insecto se asocia a la liberación de toxinas por la bacteria y a una septicemia provocada por la multiplicación bacteriana.

Materiales necesarios

Frascos de cristal de boca ancha Bandejas metálicas y plásticas Goteros y pipetas Láminas de vidrio de 2.5 cm de ancho y 2 cm más corta que el fondo de las Bandejas. Papel de filtro o sustituto que retenga la humedad Recortes de tela antiáfidos Agua destilada o hervida Larvas de G. mellonella Solución de Ji de concentración conocida. Cabinas de incubación

Procedimiento:

Los frascos de cristal se cubren interiormente colocando un disco de papel en el fondo y una franja rectangular en las paredes. Con una pipeta o un gotero se humedece el papel con una suspensión de Ji a razón de 40 Ji./larva de G. mellonella, sin que se sobre humedezca y ocurra escurrimiento (Aproximadamente 30 ml) Se colocan en el pomo 100 larvas vivas y saludables del insecto. Se tapa con tela antiáfidos para facilitar la ventilación y evitar la entrada de otros insectos y el escape de las larvas. Rotular con los datos correspondientes fecha, número del lote, de larvas y fecha de emergencia. Colocar los pomos durante doce días en la parte inferior de las cabinas de incubación, forradas de malla antiáfidos, a temperatura controlada de 27.5±2.5 oC. Temperaturas inferiores pueden provocar retardo en el desarrollo del nematodo y que a los 12 días no estén listos para emerger, obteniéndose entonces muy bajos rendimientos. Transcurridos los 12 días se destapan los pomos, se extraen los cadáveres de las larvas de galleria mellonella, se enjuagan y se colocan en trampas White para que emerjan los Ji.

Preparación de las trampas White: Preparar las bandejas de extracción, colocando dentro las láminas de vidrio. Sobre éstas se colocan tiras de papel de filtro mas anchas y se doblan los bordes sobresalientes hacia abajo. Añadir agua destilada o hervida, hasta que alcance los bordes del papel sobre las láminas de vidrio. Colocar los cadáveres de larvas de Galleria, uno junto a otro transversalmente sobre el papel que cubre las láminas de vidrio. Las trampas se colocan en la sección superior de las cabinas de incubación para impedir que las larvas de Galleria puedan ser infestadas por Dípteros que afecten la cría de nematodos. Se recomienda hacer colectas cada 24 h, para ello se extrae el agua con los nematodos y se añade nuevamente agua fresca, repitiendo este proceso al menos durante 72 h o hasta que no salgan los nematodos. El recobrado diario se deja reposar de 3 a 5 min. y se procede a decantar el exceso de agua; a continuación se procede a concentrar la solución mediante el embudo separador y finalmente se pasa por un colador de malla antiáfidos con criba no menor de 625 (orificios/cm2) para eliminar todos los restos indeseables que pudieran quedar del proceso. Los Ji obtenidos se resuspenden en agua preferiblemente destilada estéril o hervida y se pasan a bandejas plásticas donde se pueden mantener viables por algún tiempo. El nivel del agua no debe sobrepasar 0.7 cm de profundidad para garantizar la oxigenación requerida. El producto almacenado debe revisarse semanalmente y restituirle el agua perdida por evaporación; si fuera preciso se cambia el agua siguiendo el procedimiento descrito.

Control de calidad.

Para la entrega del producto final es preciso realizar las pruebas de control de calidad que garanticen la efectividad del mismo de ahí que se efectúen los análisis correspondientes.

Controles de calidad a realizar en el proceso de reproducción. Durante el proceso de reproducción masiva Es muy importante el ajuste de parámetros como son la temperatura, concentración del inóculo, tiempo total del proceso y demanda de oxígeno Observación al microscopio estereoscopio de la suspensión madre de nematodos para determinar la calidad del inóculo a utilizar en la reproducción, los Ji muertos se encuentran generalmente rectos y los vivos se mantienen moviéndose activamente. Ajustar la suspensión de nematodos para la infestación a 200 nematodos/ml empleando agua destilada estéril (ADE) o hervida y debe estar libre de contaminantes.

Soluciones posibles:

Desinfección con formalina Preparar una solución de formalina al 0. 1 %, verterla en una placa Petri y dejarla airear 24 h. posteriormente añadir 5 ml de la suspensión concentrada de nematodos y mantenerlo durante 24 h en las placas. Al cabo de este tiempo se extrae la mayor cantidad de agua y se añade agua hervida o destilada. Los protozoos habrán muerto y también muchos nematodos, sin embargo los vivos podrán emplearse como inóculo, asegurándose un pie de cría libre de contaminantes.

Refrescamiento en suelo. Suelo esterilizado al vapor (autoclave: 121oC, 1.1 atm, 30 min.) se vierte en macetas u otro recipiente apropiado, se añaden varios mililitros de la suspensión de nematodos. Deberá mantenerse el suelo húmedo. Pasada una semana se toman porciones de éste y se colocan en placas de Petri, incorporando entre 10 y 20 larvas de Galleria en cada una, se tapan y se mantienen 12 días a temperatura ambiente Al cabo de este tiempo se extraen las larvas muertas, de coloración pardo oscuro y sin fetidez, se enjuagan y se colocan en trampa White con agua destilada o hervida, para la obtención de los juveniles infestivos del nematodo que podrán ser empleados nuevamente como inóculo. Las trampas White en este caso se realizan siguiendo los mismos pasos ya descritos, pueden emplearse placas de Petri y portaobjetos en sustitución de las bandejas y láminas de cristal, por ser pequeño el número de larvas a procesar. Este método puede emplearse además para refrescar la cepa cuando alguno de los parámetros de comportamiento normal del nematodo se ven alterados (Potencial reproductivo, síntomas en Galleria. LT50, supervivencia).

Producción obtenida

Pureza Se observará la presencia de hifas o micelios de hongos, colonias bacterianas no simbióticas en suspensión a través de muestras llevadas al microscopio óptico. Los restos del tejido del insecto hospedero tampoco deben estar contenidos en la suspensión

Aplicación en campo.

El productor debe ser orientado y capacitado sobre el bioproducto que se le entrega en cuanto ha: Modo de acción del medio biológico Utilización acorde a los parámetros de calidad del mismo. Momento de aplicación oportuno Estado fenológico del cultivo Compatibilidad del biopreparado con otros productos y labores culturales empleadas en el cultivo. Selección del medio de aplicación adecuado. Dosificación Insecto plaga: estadio, hábitos, índice de infestación, distribución, susceptibilidad. Interacción medio biológico-hospedante-ambiente

Preparación del bioproducto El producto mezclado con agua se agitará bien. La dosis a aplicar será de 200 000 Ji/m2 o ruedo de planta contra Broca del café y para otras plagas puede llegar a ser de hasta 1 000 000 de Ji/m2. La concentración que debe salir por las boquillas será ³1x102 Ji/ml, para tratamientos contra broca del café. La solución final de 300-400 L/Ha, en dependencia del marco de plantación y la población del cafetal.

Equipos de Aspersión: Los equipos de aspersión (Mochila) no deben ser empleados para la aplicación de productos químicos; si esto no fuera posible deben ser sometidos a una buena limpieza utilizando abundante agua y detergente. Deben tener buena calidad y estar bien calibrados. Mantener bombeo constante (presión) para lograr la uniformidad y calidad de aplicación en toda el área tratada. Independientemente del tipo de equipo de aspersión empleado, es imprescindible mantener la suspensión en agitación.

Condiciones necesarias Una adecuada humedad en el suelo favorece la efectividad de la aplicación. Si es posible debe realizarse un riego antes de la misma, o efectuarla cuando las condiciones en este sentido sean las más favorables. Evitar aplicar en horas que la intensidad de las radiaciones solares y la temperatura son más elevadas de 12:00 M a 3:00PM Las aplicaciones se realizarán una vez concluida la cosecha y el número estará en dependencia de la efectividad de las mismas y la posibilidad de empleó de otros medios de control, pudiéndose obtener resultados satisfactorios con una sola aplicación.

Medios y medidas de protección Uso correcto de los medios de protección (Guantes, Caretas protectoras). Lavarse bien una vez concluido el trabajo.

Una mala aplicación puede traer varios efectos nocivos como son, entre otros: Control insuficiente de la plaga. Repetición de aplicaciones con incremento de los gastos en productos, fuerza de trabajo, equipos y monetarios.

Eficiencia técnica de las liberaciones.

Determinación de la efectividad técnica en campo. La Efectividad técnica del bioproducto en campo se determinará mediante la observación macroscópica y estereoscópica de muestras tomadas, previas a la aplicación y transcurridos 15 días de la misma.

Las muestras estarán compuestas por suelo y granos colectados en el ruedo de las plantas. En el caso de los granos, colectar de los que tengan síntomas de daños por broca.

Transcurrido el tiempo previsto para la observación, que puede ser inmediata a la llegada de la muestra al laboratorio, se cuentan los adultos, pupas y larvas vivos, así como los huevos viables, a simple vista o con la ayuda del microscopio estereoscópico presentes en los granos colectados.

Fuentes Suárez Pérez Rosendo, Hernández Alvides Jorge, Serrano Romero Jorge, de Armas Arredondo Georrgina.(1992). Plagas, Enfermedades y su sontrol. Editorial Pueblo y Educación. Arteaga, E.; B. Chang y O. Vázquez. Metodología de reproducción de nematodos entomógenos en bandejas. ciudad:Ciudad de La Habana, Cuba

Fernández E.; Arteaga E. y Pérez M. Utilización de los nematodos entomopatógenos en el control de plagas agrícolas. Curso Internacional de Control Biológico BIOSAV – 4. Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Ciudad de La Habana, Cuba. Del 25 al 29 de mayo de 1998