Tinción de Gram

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Tinción de Gram
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Concepto:La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias.

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Descripción

Hace casi 90 años, el doctor Hans Christian Joachim Gram describió un método de tinción que le permitía distinguir a las bacterias en cortes de tejidos de mamíferos. Con otros métodos de tinción, las bacterias resultaban difíciles de visualizar, ya que se teñían del mismo color de las células, los fragmentos histológicos y la fibrina. Los cortes histológicos tratados con el colorante de Gram, anilina-violeta de genciana, seguido de yodo-yoduro de potasio y decolorados a continuación con alcohol para eliminar el colorante de las células, de los fragmentos histológicos y de la fibrina, sin decolorar las células, bacterianas, representaba en conjunto un gran avance. Posteriormente, se demostró que con el método de tinción de Gram ciertas bacterias mantenían el color azul (grampositivas) mientras que otras eran decoloradas por el tratamiento con alcohol (gramnegativas). En sabe que existen diferencias estructurales fundamentales entre las bacterias grampositivas y gramnegativas, aunque los mecanismos exactos de tinción y decoloración no sean aún totalmente conocidos. Con el tiempo, la técnica de tinción de Gram ha sido modificada numerosísimas veces, aunque todos los métodos empleados hoy día se siguen denominando tinción de Gram. La calidad y pureza de los colorantes ha mejorado considerablemente, y en la actualidad se emplea como colorante primario el cristal violeta (compuesto químico específico), como contra tinción final se utiliza usualmente la safranina. Las bacterias Gram positivas pierden esta característica en un medio acido, que es el que predomina en muchas muestras clínicas. Así pues el colorante primario debe alcalinizarse, lo cual resulta difícil, ya que las soluciones alcalinas de cristal violeta son relativamente inestables. El mordiente de yoduro es también relativamente inestable especialmente si se encuentra en contacto con la luz y el calor. La eliminación del complejo cristal violeta-yoduro que se halla laxamente unido a las bacterias y que recibe el nombre de decoloración puede llevarse a cabo mediante lavado con etanol, una mezcla de etanol y acetona o con acetona. La acetona por si misma actúa con rapidez excesiva, lo que hace que incluso las bacterias Gram positivas pueden perder la tinción. El etanol actúa mucho más lentamente y puede no llegar a decolorar totalmente a las bacterias gramnegativas. En consecuencia se emplea generalmente una mezcla de etanol y acetona.

Método

El método mas adecuado para practicar una tinción de Gram depende en parte del microorganismo que se desea teñir, la matriz en que se halla suspendido y los prejuicios personales del investigador que practica la tinción. Continuamos con la descripción de la aplicación del método que ha sido útil en la mayoría de los casos.

Técnica

  1. Preparar una extensión delgada y uniforme sobre el portaobjetos y dejar secar sin calentar. En el caso de las muestras obtenidas con gasas o algodones por frotamiento hay que hacer girar la muestra, apretando firmemente en una pequeña zona del portaobjetos. Si se trata de líquidos como orina o cefalorraquídeos se coloca una gota en el centro del portaobjetos y se deja secar sin extender. Los materiales más densos, como el pus y los esputos, pueden extenderse uniformemente, evitando sobre todo que queden zonas excesivamente gruesas.
  2. Pasar el portaobjetos por una llama de gas varias veces con el fin de matar las bacterias y fijarlas a este.
  3. Cubrir el portaobjetos con solución de cristal violeta; añadir inmediatamente 2-3 gotas de solución de bicarbonato de sodio y mezclar, inclinando el portaobjetos o soplando sobre el. Dejar teñir durante 30-60 segundos.
  4. Inclinar el portaobjetos para decantar el colorante y cubrir el cristal violeta con yoduro. Dejar en reposo durante 30-60 segundos.
  5. La decoloración constituye el paso mas critico de la técnica. Inclinar el portaobjeto para decantar la solución de yoduro, y lavarlo con acetona-alcohol, manteniéndolo en un ángulo de más de 15 grados, hasta que la solución deje colorearse de azul. No hay que intentar decolorar las zonas mas gruesas de la extensión, ya que de esta forma se decoloran excesivamente las zonas menos gruesas, que son precisamente las que podrán ser estudiadas en el microscopio.
  6. Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua fría corriente para eliminar el alcohol-acetona, y detener así la decoloración.
  7. Cubrir el portaobjetos con safranina; dejar 15-30 segundos y lavar con agua corriente.
  8. Secar con un paño la parte inferior del portaobjetos para eliminar los restos del colorante; dejar secar al aire.

Limitaciones

La duración de cada paso no es crítica, y puede variar en unos segundos y hasta 5 minutos. De hecho los reactivos pueden aplicarse sucesivamente con tanta rapidez como permita la manipulación de los colorantes. La decoloración es la fase mas critica. La tendencia es siempre decolorar excesivamente, lo cual hace que las bacterias grampositivas parezcan gramnegativas. Hay que lavar el portaobjetos con acetona-alcohol hasta que deje de colorearse la solución de azul en las zonas menos gruesas. A continuación hay que lavar el portaobjetos y dejar secar el contenido al aire para posteriormente estudias en el microscopio. En caso de urgencia, puede secarse con papel absorbente. Sin embargo, a pesar que se seque de la forma más cuidadosa posible, siempre se arrastra parte del material.

Aplicaciones

Prácticamente, todas las muestras clínicas deben ser estudiadas en el microscopio, para determinar la proporción de microorganismos y los elementos celulares presentes. Para este tipo de preparación, la coloración de Gram constituye la técnica mas adecuada. En la tinción de Gram se da esta diferencia ya que las de Gram negativas se da esta diferencia ya que las Gram negativas se decoloran. Si la tinción es buena, los elementos celulares presentan un color rosado o rojizo (todas las células de los mamíferos son gramnegativas) y las bacterias se tiñen de color azul oscuro (grampositivas) o rojo (gramnegativas). Si existen hongos estos son siempre grampositivos. Ciertas bacterias grampositivas se decoloran con mayor facilidad que otras, especialmente en muestras clínicas y en cultivos antiguos con medios artificiales. Aunque ciertas bacterias grampositivas pueden aparecer como gramnegativas, lo contrario no ocurre nunca. En las muestras clínicas se encuentran con frecuencia artefactos, que puede confundirse con bacterias lo cual puede conducir a conclusiones erróneas

Fuentes

  • Paul D. Hoeprich, M. D. Tratado de enfermedades infecciosas. Tomo I. Pág. 77. Edición Revolucionaria. La Habana. Cuba. 1982.