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Bacterias del género Bacillus

Bacterias del género Bacillus 

La contaminación del ambiente marino por hidrocarburos del petróleo, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El bioproducto BIOIL-FC, diseñado para combatir los derrames de petróleo, está formado por bacterias degradadoras de hidrocarburos, tales como Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60. El presente trabajo está dirigido a determinar y comparar los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60 en n-hexadecano mediante el conteo en cámara de Neubauer y el método de Lineweaver-Burk, así como definir los nuevos modelos de inhibición del crecimiento.

El  Bacillus licheniformis cepa CBM-60 degrada el n-hexadecano a mayor velocidad que el Bacillus alcalophilus cepa CBM-225, no reflejando inhibición de su crecimiento en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, la composición bacteriana del bioproducto BIOIL-FC puede ser enriquecida con una mayor proporción de la cepa CBM-60 para combatir derrames de petróleo con altas concentraciones en n-hexadecano.

La contaminación ambiental por hidrocarburo

La contaminación ambiental por hidrocarburos del petróleo y en particular del ambiente marino, es cada vez más alarmante por los nefastos daños que ocasiona. El océano constituye un ecosistema muy dinámico y complejo, que el hombre está destruyendo con contaminantes químicos, entre ellos el petróleo y sus derivados, llegando a comprometer la trama alimentaria del medio marino.
La posición geográfica de nuestro archipiélago y el tráfico marítimo en torno al mismo, así como la creciente explotación y perforación de pozos de petróleo en nuestra plataforma, aumentan considerablemente la posible contaminación de las costas.

Desde finales de la década del 80 del siglo pasado, el departamento de Microbiología Aplicada del Centro de Bioproductos Marinos (CEBIMAR) perteneciente al Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente, ha trabajado en el aislamiento y conservación de bacterias aisladas de ecosistemas marinos capaces de degradar petróleo [1], las cuales forman parte de la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del centro en la actualidad
A partir de una selección de estas cepas se formuló el bioproducto BIOIL-FC. La efectividad de este bioproducto se ha comprobado durante los tratamientos de derrames de petróleo ocurridos en las Bahía de Cienfuegos y de Matanzas, en el recalo accidental de petróleo que contaminó la Playa Arroyo Bermejo en Jibacoa y en la Ensenada de Arroyo Blanco en Holguín [2]con resultados satisfactorios.

Bioil- Fc

El BIOIL-FC está formado por cinco bacterias degradadoras de hidrocarburos, Dentro de éstas se encuentran Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 y Bacillus licheniformis cepa CBM-60 como las más importantes y las escogidas para desarrollar el siguiente estudio.

Microorganismos empleados

El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa CBM-225 [3]aislados de los sedimentos de la Bahía de Cárdenas, Matanzas y pertenecientes a la CBM del CEBIMAR.

Medios de cultivo

Para la conservación de las cepas CBM-225 y cepa CBM-60 se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según [4], la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana de la cepa CBM-225 se realizó según [5] y para la cepa CBM-60 se llevó a cabo según [6]. Los estudios cinéticos del crecimiento se desarrollaron en el medio de degradación de hidrocarburos propuesto por [7], estos medios contenían concentraciones de n-hexadecano (Merck-Schuchardt, 99 % de pureza) de 5, 10, 20, 30, 40 y 60 g. L-1,

Condiciones de cultivo en zaranda

Todos los experimentos desarrollados a escala de zaranda fueron realizados a partir de cultivos de 24 horas en cuñas de medio # 6 agarizado [8]. Con este cultivo se obtuvo el preinóculo en el medio de obtención de biomasa [9]. Luego de 24 horas, el cultivo fue inoculado a una concentración inicial de 106 celmL-1 en los medios de degradación [10], de los cuales fueron tomadas muestras cada cuatro horas. Todos los experimentos fueron desarrollados a escala de zaranda orbital rotatoria Infors a 125 r.min-1 y 30 ºC.
Los medios de cultivo fueron esterilizados a 121 oC por 15 minutos y fue utilizado como control un medio de cultivo estéril en las mismas condiciones.

Crecimiento microbiano en medio de degradación de hidrocarburos

La determinación del crecimiento microbiano en el medio de degradación de hidrocarburos se realizó mediante el conteo total de células en cámara de Neubauer [11].
Velocidad específica de crecimiento (µ)
La µ fue determinada en la fase exponencial del crecimiento, mediante el modelo de crecimiento no restringido [12].
Determinación de los parámetros cinéticos del crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60

Para cada una de las concentraciones de sustrato fue calculada en la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento de las cepas CBM-225 y CBM-60. A partir de ellas fueron estimados los valores de velocidad específica de crecimiento máxima (µmax) y de la constante de disociación o constante de afinidad (Ks) mediante la transformación lineal de Lineweaver-Burk [13]. Además, fue determinada la constante de inhibición (Ki) de ambas cepas con n-hexadecano según la expresión de Andrews linealizada [14].
Determinación del modelo cinético de las cepas CBM-225 y CBM-6.

La determinación de los nuevos modelos cinéticos y los valores de Ki en la zona de inhibición del crecimiento de ambas cepas se realizó mediante la ecuación modificada de Andrews según [15].

Referencias

  1. Joseph, N.; Capó, M. C.; Bellota, M.; Ramos, Y.; Fuentes, M. (1994): Aislamiento y selección de microorganismos degradadores de hidrocarburos en la plataforma cubana. Revista Ciencias Biológicas. Microbiología. 27:137-148..
  2. Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.
  3. Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.
  4. Gorbienko (1961)
  5. Gorvienko, Y. A. (1961): Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos. Mikrobiol. 30(1) 168-172.
  6. Ortiz, E. (2004): Obtención de un tensioactivo a partir de una bacteria marina para la biorremediación de la contaminación con hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp:15-62.
  7. Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.
  8. Gorvienko, Y. A. (1961): Sobre las ventajas cualitativas del agar nutriente en medios de cultivos para microorganismos heterótrofos. Mikrobiol. 30(1) 168-172.
  9. Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.
  10. Núñez, R. (2003): Obtención, caracterización y aplicación de un bioproducto bacteriano para la bioremediación de derrames de hidrocarburos. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana. Cuba. pp: 50-89.
  11. Martínez, J.; Sánchez, A. I.; Quintana, M.; Pazos, V.; Del Barrio, G. (1989): “Microbiología General”. Editorial Pueblo y Educación. 3: 31-101.
  12. López, J.; Gódia C. F. (1998): Ingeniería Bioquímica. 1ra Edición. Ed. SINTESIS, S.A. pp: 9-45.
  13. Chavez, P. M.; Díaz, D. J.; Pérez, L. V.; Delfín, G. J. (1990):Temas de Enzimología. Tomo I. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:51-87..
  14. Boyer, R. (1999): Concepts in Biochemistry. Ed: Keith Dodson. Chapter 4. Amino acids, peptides, and proteins. pp78-110, Chapter 6. Enzymes as biological catalysts. 142-170pp and Chapter 15. Metabolism of carbohydrates. pp:445-483. Copyright © by Brooks/Cole Publishing Company. USA.
  15. Cabranes Y. C. (2005). Cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo por Bacillus alcalophilus cepa CBM-225. Tesis de maestría. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. pp:28-49.

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