Conservación in vitro de Recursos Genéticos Vegetales

Conservación in vitro de Recursos Genéticos Vegetales

Conservación in vitro de Recursos Genéticos Vegetales. Constituye parte esencial de la estrategia general para la conservación y el intercambio de recursos fitogenéticos a nivel mundial. Es una alternativa para la preservación de material vegetal con fines investigativos, para la propagación masiva de plantas y ha permitido el fomento y desarrollo de bancos de germoplasma in vitro que han tributado a la comunidad científica y al mantenimiento de una importante biodiversidad.

Historia

La conservación de germoplasma vegetal como actividad científica fue propuesta en los años 70 del siglo XX con el objetivo de prevenir la erosión genética y mejorar la productividad agrícola de muchas especies a partir de la conservación de diferentes especies y genes de interés. Existen dos estrategias básicas para la conservación de germoplasma vegetal, la conservación in situ y la conservación ex situ.
En la conservación in situ las especies se mantienen en su hábitat natural, generalmente en parques nacionales, reservas biológicas y reservas ecológicas. Mientras que, en la conservación ex situ las especies se preservan fuera de su hábitat natural, en bancos de semillas botánicas, bancos de plantas en campo o en bancos de plantas in vitro.
Los bancos de semillas botánicas resultan de gran utilidad en especies que se propagan sexualmente y cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento, pero no deben aplicarse para conservar especies de plantas con semillas botánicas de corta supervivencia, ni pueden emplearse en caso de trabajar con plantas autoincompatibles, o plantas de propagación vegetativa obligada. En estos casos, la diversidad genética de estas especies se puede conservar mediante bancos de plantas en campo o mediante técnicas de conservación in vitro.
Los bancos en condiciones de campo tienen como limitante que se necesitan grandes extensiones de tierra, los costos por mantenimientos asociados a las labores agrotécnicas son altos, se hace necesario controlar plagas y enfermedades y además son vulnerables a los desastres climáticos. Es por ello, que el desarrollo de nuevas técnicas de conservación, han permitido preservar mejor los recursos genéticos importantes para muchos países.

Avances

En particular, los avances alcanzados en el cultivo in vitro en diferentes especies vegetales dieron la posibilidad de desarrollar nuevas alternativa para la conservación ex situ, al permitir disponer de suficientes individuos en períodos de tiempo relativamente cortos y facilitar la manipulación del material vegetal al ser plantas con un desarrollo fisiológico homogéneo. Desde entonces, la conservación in vitro de germoplasma vegetal constituyó una herramienta de trabajo que apoyó la conservación de semillas botánicas y la conservación en campo, ya que permitió tener duplicados seguros de aquellos genotipos de particular interés.
Esta vía de conservación puede efectuarse a través de dos métodos: el crecimiento mínimo y la crioconservación.
El método basado en el crecimiento mínimo es el más generalizado, se basa en modificar las condiciones óptimas de cultivo, para disminuir la velocidad de crecimiento normal de la especie objeto de estudio, con lo cual se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco.

Importancia

La conservación in vitro de germoplasma vegetal ofrece la posibilidad de almacenar un elevado número y variedad de muestras en un área reducida y facilita el acceso a ellas para su evaluación. Sus condiciones asépticas garantizan mayor sanidad de las muestras y en consecuencia permiten incrementar el intercambio de materiales vegetales sanos.
El principal objetivo de los bancos de germoplasma in vitro es conservar las especies que presentan semillas botánicas de corta y poca viabilidad, cultivos de propagación vegetativa o clonal, o que son altamente heterocigóticos y requieren ser propagados vegetativamente para conservar su integridad genética. También se han incluido raíces y tubérculos de corta vida en el proceso de almacenamiento, como Solanum tuberosum L. (papa), Ipomoea batata L. (boniato) y Manihot esculenta Crantz (yuca).

Bancos de germoplasma in vitro

Son sitios para la conservación de los recursos genéticos en condiciones controladas de laboratorio y que involucran diversas técnicas de cultivo y almacenamiento in vitro. En los mismos se busca maximizar la diversidad de ejemplares recolectados de poblaciones en campo o en su centro de origen. La unidad de colección que se mantiene en condiciones controladas puede ser la semilla botánica o explantes vegetativos, dependiendo principalmente del hábito de crecimiento de la especie.
Para proveer a los explantes y semillas las condiciones adecuadas de almacenamiento in vitro se han desarrollado técnicas que permiten mantener una alta diversidad en espacios reducidos, en condiciones asépticas y a salvo de los riesgos ambientales que podrían provocar su pérdida. Por ejemplo, embriones y cotiledones de Arachis retusa fueron conservados in vitro para superar los problemas de baja viabilidad en el almacenamiento de la semilla sexual, debido al alto contenido lipídico.
Además, con el cultivo in vitro se facilita el intercambio de material genético, ya que muestras pequeñas pueden ser enviadas en condiciones asépticas, incluso a países con regulaciones fitosanitarias muy estrictas.

Tipos de almacenamiento in vitro

El almacenamiento in vitro se puede clasificar, según su duración, en "almacenamiento por corto plazo" (conocido en inglés como "short-term storage") cuyo objetivo es reducir la velocidad de crecimiento del material vegetal, por lo que generalmente se utilizan técnicas que fomenten el crecimiento reducido, y "almacenamiento por largo plazo" ("long-term storage"), donde se utiliza la crioconservación que garantiza la conservación in vitro por períodos prolongados de tiempo.
El método de crecimiento mínimo ha sido ampliamente utilizado en la práctica para la conservación de germoplasma, existen varios ejemplos de su aplicación en la creación de bancos in vitro. Entre otros, se pueden mencionar los casos de Saccharum sp. (caña de azúcar), yuca y papa. Este método constituye una de las principales variantes que puede garantizar el éxito de un programa de conservación, debido a que es relativamente sencillo y puede ser establecido con facilidad con el equipamiento que normalmente existe en un laboratorio de cultivo de tejidos.
Este método es conocido también como crecimiento reducido pues como se ha explicado se basa en la disminución de la división celular y el metabolismo de la planta. Tiene como objetivos incrementar la longevidad in vitro de los cultivos sin que se produzcan cambios genéticos, por tanto, no hay una detención total de los procesos celulares sino una disminución en la velocidad conque ocurren los mismos y así se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco.
La modificación en la composición de los medios de cultivo es una forma de limitar el crecimiento, por ejemplo, el crecimiento in vitro de plantas de yuca disminuyó proporcionalmente con el contenido de nitrógeno total del medio de cultivo; concentraciones por debajo de 10mM, en término de número de tallos y nudos por tallos resultaron perjudiciales.
Se ha conservado, con calidad y durante seis meses sin realizar subcultivos, plantas in vitro de caña de azúcar, con la reducción de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) entre 25 y 50% de su concentración normal.
Otra opción puede ser el aumento de la concentración osmótica del medio de cultivo, la limitación del crecimiento por este efecto se debe a la reducción de la adsorción de agua y nutrientes del medio de cultivo. La sacarosa como es altamente metabolizable, puede actuar como agente osmótico en concentraciones elevadas. Otros agentes osmóticos no metabolizables, como el manitol y el sorbitol, son más efectivos en la limitación del crecimiento, porque interactúan con el contenido de sacarosa y la temperatura de conservación.
La intensidad y calidad de la luz, son otros factores importantes en el control de la velocidad de crecimiento, especialmente en su interacción con la temperatura, que como ya se ha expresado, es otro de los factores más utilizados en la conservación mediante el método de crecimiento mínimo.

Almacenamiento por corto plazo

En el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta por 12 meses, manejando condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre subcultivos.
Como parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los explantes y aumentar los intervalos entre subcultivos, está el reducir la temperatura de los cuartos de crecimiento, modificar los medios de cultivo y otros factores ambientales que se deben tomar en cuenta para optimizar el almacenamiento.

Principales factores

Temperatura

Al disminuir la temperatura de cultivo, se produce una reducción en la actividad metabólica y, en consecuencia, en el crecimiento de los explantes (esta temperatura depende de los requerimientos de cada especie). Generalmente se utilizan temperaturas alrededor de los 4°C para cultivos de clima templado y entre 10 y 15°C para el germoplasma tropical. El control de la temperatura se combina usualmente con otros factores para lograr un crecimiento reducido. En banano, temperaturas reducidas se han combinado con reducción en la intensidad lumínica o la completa supresión de luz. La propagación vegetativa de los tallos de banano normalmente se realiza a 22 °C con una intensidad lumínica de 3000 lux. Sin embargo, para su almacenamiento por corto plazo, se colocan a 15°C bajo una intensidad lumínica de 1000 lux.
Si se mantienen los explantes a temperaturas bajas (inferiores a 4°C) por períodos prolongados, pueden presentarse daños fisiológicos, causados por el frío, que inciden en cambios en el metabolismo, en el contenido de proteínas, y en la composición y funcionamiento de las membranas. Estos problemas pueden ser reversibles cuando no hay exposición prolongada a esta condición. Generalmente, las plantas tropicales son sensibles a daños por frío y la temperatura de almacenamiento depende de la sensibilidad particular de cada especie. Por ejemplo, la temperatura de almacenamiento óptima para microtallos encapsulados de piña (Ananas comosus L.) es de 8ºC para un periodo de 45 a 60 días. En las especies no tropicales, la reducción de temperatura actúa, muchas veces, como señal para romper el estado de reposo de los explantes e inducir la activación de su crecimiento. Por ejemplo, el almacenamiento de lirio (Lilium longiflorum L.) a bajas temperaturas (0–10ºC) induce la ruptura del estado de reposo que lleva, consecuentemente, a su germinación y floración. Por lo tanto, su almacenamiento in vitro debe ser realizado a 25ºC, en medio de cultivo con todas las sales minerales a un cuarto de su concentración y vitaminas del medio Murashige y Skoog (1962) (MS) y una concentración alta de sacarosa (9%) por 28 meses. Además, el manejo de la temperatura se puede combinar con una reducción de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo, aspecto que también es de gran importancia. Ambas medidas permiten retardar el proceso de crecimiento y prolongar el almacenamiento.

Medio de cultivo

La reducción en la concentración de elementos minerales y/o carbohidratos metabolizables (por ejemplo, sacarosa) en el medio de cultivo puede ser una estrategia importante para la reducción del crecimiento del explante. Otras medidas pueden ser el aumentar el potencial osmótico del medio (especialmente mediante el uso de carbohidratos no metabolizables, como el manitol), el uso de concentraciones mayores de gelificantes, la adición de ciertos reguladores de crecimiento (como el ácido abscísico [ABA]), o de otras sustancias (como el cloruro de magnesio) para reducir daños en el explante. Como consecuencia de las medidas anteriores, el explante absorbe los nutrientes más lentamente y ocurre una reducción en el crecimiento.

Recipiente de cultivo

El volumen del recipiente de cultivo puede ser determinante para definir la frecuencia de subcultivos y el almacenamiento óptimo de los explantes.

Modificación del ambiente gaseoso

La reducción del crecimiento se puede lograr también al disminuir el nivel de oxígeno disponible para los explantes. Sin embargo, bajo esas condiciones de almacenamiento, a menudo se desarrollan tejidos hiperhídricos, necróticos y con crecimiento más lento. La hiperhidricidad es un desorden fisiológico que se caracteriza por la apariencia vidriosa e hinchada en los tejidos, tallos turgentes, acuosos e hipolignificados y órganos translúcidos, verdes, quebradizos y con deformaciones en la cutícula y epidermis. La necrosis de explantes, a causa de la reducción de oxígeno, se ha logrado disminuir al adicionar nitrato de plata, giberelinas, fructuosa, calcio, ácido ascórbico y/o carbón activado al medio de cultivo.
Un método para la modificación del ambiente gaseoso consiste en bajar la presión parcial del oxígeno usando atmósferas controladas o disminuyendo la presión atmosférica de la cámara. Esto ha permitido el almacenamiento in vitro de especies tropicales sensibles a bajas temperaturas. Otro método para limitar el nivel de oxígeno disponible es el uso de una capa de aceite mineral o medio líquido para cubrir los explantes.

Bancos de germoplasma in vitro en cultivos tropicales

La mayoría de los bancos de germoplasma in vitro especializados en plantas tropicales se encuentran asociados a centros internacionales de investigación o conservación y, en menor grado, a universidades. Un ejemplo es el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), en Costa Rica, donde se ha trabajado en el desarrollo de protocolos adecuados para el almacenamiento in vitro de embriones cigóticos, embriones somáticos, ápices y semillas de diferentes genotipos de café, así como de suspensiones celulares de esta misma especie y de Musa spp. Esto, además, ha facilitado el intercambio de recursos fitogenéticos con productores y con organismos internacionales.
El CIAT ha conservado maíz (Zea mays) y Yuca (Manihot esculenta); el Centro de Internacional de la Papa (CIP) variedades locales de papa, el IITA frijol ñame (Sphenostylis stenocarpa), caupí (Vigna unguiculata), maní bambara (Vigna subterranea), soya (Glicine max) y yuca (Manihot esculenta). También, institutos miembros del Grupo Consultivo de Investigación en Agricultura Internacional (The Consultative Group on International Agricultural Research [CGIAR]), que colaboran con organismos oficiales en diferentes zonas de Medio Oriente, América, Asia y África, se dedican principalmente a la investigación científica para fomentar el crecimiento agrícola sostenible que fortalezca la seguridad alimentaria y como tarea fundamental tienen el mantener bancos de germoplasma internacionales que preservan y facilitan el acceso a los recursos genéticos.
El grupo Biodiversidad Internacional (Biodiversity International [BI], anteriormente conocido como "The International Board for Plant Genetic Resources" [IBPGR]), con sus diferentes sedes de América, Asia, el Pacífico, Oceanía, Europa y África, se ha centrado en la conservación in vitro, por medio del crecimiento lento, de tallos de cacao, mango, banano, plátano, aguacate, papa (proveniente del CIP por intercambio de materiales), yuca, especies de Allium, minitubérculos de ñame (Dioscorea spp.) (provenientes del IITA), tiquisque (Xanthosoma spp.) y malanga, taro, chamol o ñampí (C. esculenta) y algunas especies forrajeras (Cynodon spp. y Digitaria spp.). Además, BI ha empleado la crioconservación para almacenar embriones cigóticos de coco, semillas de cacao, semillas de aguacate, meristemos de camote y papa, explantes de caña de azúcar (Saccharum officinarum) y Citrus spp. En cuanto a cultivos básicos para la alimentación en África y Asia, se ha trabajado principalmente con Allium spp., maíz y arroz. La Red Internacional para el Mejoramiento de Banano y Plátano ([INIBAP/IPGRI] por su nombre en inglés "Internacional Network for the Improvement of Banana and Plantain, Bélgica) se especializa en mantener un banco de germoplasma in vitro de banano y ha hecho esfuerzos por eliminar enfermedades durante su almacenamiento. Por ejemplo, por medio de la crioconservación se eliminó el virus del mosaico del pepino en meristemas apicales de esta especie. Las universidades de Taiwán y Camboya establecieron un banco de germoplasma in vitro de cítricos, en conjunto con el Centro Long Dinh de Investigación en Fruticultura (LDFRC, por sus siglas en inglés) en Vietnam. A partir de recursos fitogenéticos conservados en este banco se generaron nuevas variedades con tolerancia y resistencia a varias enfermedades. El banco posee 15 variedades de naranja, 11 variedades y cinco especies silvestres de limón, 45 variedades de pomelo y más de 27 variedades pertenecientes a seis especies e híbridos.
En Asia, el Centro de Tecnología en Alimentos y Fertilizantes (Food and Fertilizer Technology Center [FFTC]) utiliza un banco de germoplasma para salvar de la extinción materiales silvestres de arroz y banano y así poder utilizarlos en programas de mejoramiento genético.
Existen otros esfuerzos más pequeños y limitados, que también se enfocan en cultivos tropicales y que procuran la seguridad alimentaria y el desarrollo de metodologías para especies poco investigadas, como la crioconservación de varias especies del género Dioscorea (con potencial como substituto de la papa) en el Instituto de Genética de Plantas e Investigación en Cultivos Vegetales, Gatersleben, Alemania, meristemas apicales de camote en el Instituto de Biotecnología Kagoshima, Japón y tallos de caña de azúcar provenientes de embriones somáticos por medio de crecimiento lento in vitro con subcultivos cada dos meses en el laboratorio de conservación de germoplasma de la Escuela de Biología y Ciencias de la Conservación de la Universidad de KwaZulu - Natal, en África del Sur. En Cuba, el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT) es el encargado de la conservación de germoplasma de raíces y tubérculos tropicales, plátanos y bananos) y mantiene, además de las colecciones de campo, colecciones in vitro de estas especies vegetales. Con la utilización de manitol reducen el crecimiento de las plantas in vitro de yuca, ñame , malanga (Xanthosoma spp.) y boniato. En general, los bancos de germoplasma in vitro son una herramienta útil para la conservación de recursos genéticos de cultivos tropicales de importancia agrícola y alimenticia.

Fuente

• García-Águila, Leyanis; de Feria M; Acosta Karen (2007). Aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal. Biotecnología Vegetal 7 (2): 67 – 79.
• Murashige, T. y F. Skoog. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum. 15: 473-497.
• Rayas, A; Cabrera M; Gutiérrez V; García M; López J; Rodríguez S; Milián M; Medero V; Basail M; Santos A; Torres Y; Bauta M; Toledo H (2008). Efecto del manitol sobre la conservación in vitro de germoplasma de Dioscorea alata. XI Encuentro de Botánica “Johannes Bisse In Memoriam”. 14 al 17 de noviembre/2008. CD memorias, ISBN. 978-959-18-0395-5.
• Rayas, A, Mederos V, García M, López J, Cabrera M, Ventura J, Martínez M, Gutiérrez V, Álvarez M, Bauta M (2002) Estudio de medios de cultivo para la conservación in vitro de la yuca. Biotecnología Vegetal 2(4): 249-251.