Técnicas de diagnóstico de virus vegetales

Técnicas de diagnóstico de virus vegetales

Técnicas de diagnóstico de virus vegetales. Técnicas de diagnóstico empleadas para la detección de virus en especies vegetales. El diagnóstico de virus vegetales se ha abordado con diferentes enfoques, y todos han estado condicionados inevitablemente por el desarrollo y avance de la tecnología. En su evolución ha transitado desde el análisis de síntomas en plantas indicadoras hasta las técnicas moleculares (Díaz et al., 2010). Las técnicas moleculares, son las más sensibles en el diagnóstico de los virus.

Plantas indicadoras

Las plantas indicadoras pueden emplearse para la identificación de enfermedades virales, mediante la sintomatología desarrollada. Estas plantas deben ser variedades muy susceptibles de la misma especie estudiada o de otras especies que desarrollen síntomas característicos en el menor tiempo posible, debe tener reproducción por semilla y ser de talla pequeña. Este método se ve influenciado por la temperatura ambiental, por lo que se debe tener en cuenta la época del año para su utilización.

Microscopía óptica y electrónica

Uno de los cambios causados en la célula por una infección viral es la producción de pequeños cuerpos de inclusión que difieren de las estructuras celulares normales. La localización de éstos cuerpos de inclusión puede ser citoplasmática o nuclear y su composición y forma pueden variar. Las diferentes variantes, por sus características permiten realizar un diagnóstico certero del virus. Mediante la microscopía óptica de contraste de fase con tensión permite diferenciarlas de los elementos celulares. Es un método seguro para diagnosticar a una planta como enferma pero no fiable para afirmar que esté sana.
La microscopía electrónica tiene dos ventajas: la rapidez con la cual se obtienen los resultados y la evidencia visual convincente e inequívoca. La detección de virus a través de la microscopía electrónica no solo favorece el diagnóstico, sino que es una herramienta valiosa para obtener datos morfológicos de las partículas virales (forma, tamaño y estructura). Se puede emplear en cualquier etapa del cultivo in vitro de tejidos, desde el incipiente desarrollo de un explante hasta la planta desarrollada fuera del medio de cultivo.

Técnicas inmunoquímicas

Entre las técnicas inmunoquímicas más utilizadas para la identificación de los potyvirus se destacan las diferentes variantes de ELISA. Esta técnica inmunoenzimática forma parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados para poder visualizar la reacción antígeno-anticuerpo y se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa o la fosfatasa), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno ó anticuerpo) insolubilizados sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y por tanto, podrá fácilmente ser revelada mediante la adición del sustrato, que al actuar sobre la enzima, producirá un color fácil de detectar a simple vista o cuantificable mediante un espectrofotómetro. Es una técnica altamente sensible y de gran especificidad, que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y económica. El ELISA presenta buena reproducibilidad y facilidad en la interpretación de los resultados. Se han logrado grandes avances en esta técnica, por lo que es posible tanto la determinación de antígenos como de anticuerpos, con solo variar el tipo de ELISA. Es importante incluir un control negativo y uno positivo ya que permite detectar anormalidades que se presenten durante el diagnóstico.

Técnicas moleculares

En la actualidad, las técnicas moleculares desempeñan el papel protagónico en el diagnóstico de los potyvirus. Estas técnicas son superiores a las inmunoquímicas en especificidad y sensibilidad, ofrecen mayores posibilidades de detección y brindan una información más completa sobre los agentes patógenos. La Hibridación de Ácidos Nucleicos (HAN) y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), han sido las de mayor aplicación para lograr estos propósitos. La HAN se basa en el principio de la complementariedad de las bases que permiten la unión del ácido nucleico genómico del patógeno previamente fijado a un soporte sólido (normalmente membranas de nitrocelulosa o nylon), con moléculas complementarias que reciben el nombre de sonda (ya sea ADNc clonado o no, cebadores sintéticos o ARNc obtenidos por transcripción in vitro). En particular, el objetivo de la HAN es la detección específica de una secuencia de ADN presente en una muestra biológica, con la ayuda de una sonda marcada, que se sintetiza in vitro. Se emplean nucleótidos marcados radioactivamente con 32P, o no radioactivamente con biotina o digoxigenina. La sonda que no se une es eliminada y los híbridos son detectados por métodos quimioluminiscentes, colorimétricos o radiográficos.
La técnica PCR se basa en el principio de la complementariedad de las bases de los ácidos nucleicos y la capacidad de síntesis del ADN por parte de una enzima polimerasa. Consiste en la síntesis in vitro de ácidos nucleicos, por lo que se puede amplificar un segmento determinado de ADN, mediante cebadores que lo flanquean. En este proceso se necesitan ciclos sucesivos de desnaturalización térmica del ADN, hibridación de los cebadores a las secuencias complementarias y extensión de los cebadores anillados mediante la enzima ADN polimerasa termoestable. Los productos de extensión son complementarios a los cebadores, como resultado en cada ciclo se duplica la cantidad de ADN sintetizada en el ciclo anterior, de forma que ocurre una amplificación exponencial del fragmento. En el caso particular de los agentes virales, cuyo material genético está constituido por ARN se utiliza una variante de PCR con Trascripción Inversa (RT-PCR), que requiere una reacción preliminar de síntesis de una cadena de ADN complementaria al genoma viral, lo que se realiza con la utilización de una enzima reverso transcriptasa comercial. Los procesos de extracción y purificación de ARN se pueden considerar como los pasos más críticos e inestimados durante la detección por RT-PCR de los virus de genoma ARN.

Fuentes

• Díaz, A., M. Quiñones, F. Arana, M. Soto y A. Hernández. (2010). Potyvirus: Características generales, situación de su diagnóstico y determinación de su presencia en el cultivo del pimiento en Cuba. Rev. Protección Veg. 25(2): 69-79.
• González, J. E.; R. Hernández; O. Portal; A. Pairol y Y. González. (2005). Metodología para el diagnóstico molecular del Virus del Mosaico de la Malanga para la certificación de plantas in vitro de clones comerciales de malanga. Biotecnología Vegetal 5(1): 27 – 32.
• González Vázquez, Rosa Elena. (2011). Metodología de certificación al Virus del Mosaico de la Malanga (DsMV) en líneas donantes de Xanthosoma spp. en Cuba. Tesis presentada en opción al título de Licenciada en Biología. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Biología. 60 p.