Microscopía
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Microscopía. La microscopía es la ciencia que se ocupa de los usos y de las aplicaciones interpretativas de los microscopios, los cuales hacen posible que partículas muy pequeñas sean percibidas por el ojo humano.
Sumario
Historia
La historia de la microbiología va estrechamente ligada a la de la microscopía. La aparición de las lentes, la observación de protozoos y bacterias, y el desarrollo científico- técnico en el campo de la microscopía, han ido marcando hitos de avance en el conocimiento de los organismos vivos imperceptibles por el ojo humano. Según Barrer, la microscopía tiene dos objetivos principales; el primero es la formación de una imagen aumentada con la menor cantidad posible de defectos ópticos y el segundo, lograr el contraste.
Función
El poder de resolución de un microscopio es la distancia que debe separar a dos fuentes luminosas puntiformes, si estas se han de ver como dos imágenes distintas. El ojo humano logra la resolución cuando el ángulo visual es lo bastante amplio para que los rayos de luz, procedentes de dos puntos distintos, encuentren diferentes elementos receptores en la retina. De este modo la distancia lineal entre objetos o poder de resolución del ojo humano desnudo es de apróximadamente 0,07 mm. Una de las propiedades más importantes de la luz es la longitud de onda, representada por la letra griega lambda (λ). En la luz empleada para la observación microscópica, dicha propiedad está estrechamente relacionada con la resolución que puede obtenerse. El límite de resolución (d ) depende de la apertura numérica del objetivo (AN) y de la longitud de onda de la luz usada (λ), lo cual está definido por la fórmula matemática:
fórmula matemática
Por lo tanto, la mejor resolución (“dmin” más pequeña) se obtiene usando la menor longitud de onda y el lente objetivo de la mayor apertura numérica posible. La amplificación útil de un microscopio es aquella que permite observar las más peque- ñas partículas susceptibles de resolución. Es importante señalar que una mayor amplificación no daría siempre una mejor resolución de los detalles y conllevaría la reducción del área de observación, los llamados campos microscópicos.
Clasificacion de Microscopios
Microscopios Luminosos
Son los microscopios que utilizan luz visible con el fin de hacer observable un espécimen.
Microscopio luminoso simple
Está compuesto por una sola lente de aumento, de gran campo, que produce una imagen vertical. Su uso está limitado por su baja AN y su resolución es de unos 10 m. Estas lentes son útiles para la disección, para las mediciones y para el examen de las reacciones de aglutinación. En los laboratorios de microbiología se utilizan en los contadores de colonias, donde aparecen adaptadas a una base e iluminación apropiadas para el objetivo que se persigue con el equipo. Algunos de los problemas que se presentan con el uso de una sola lente, como el no poder colocar el campo total dentro del foco y la presencia de anillos coloreados alrededor de los objetos observados, se resuelven en la actualidad con el uso de varias lentes combinadas.
Microscopio luminoso compuesto
Consta, por lo menos, de dos sistemas de lentes. El objetivo, de múltiples compartimentos con breves longitudes focales, que forma una diminuta imagen real invertida en el plano focal de otra lente; y la lente ocular, la cual magnifica la imagen para que el observador pueda resolverla. Estos microscopios pueden tener uno o dos lentes oculares, denominándose microscopio monocular o binocular respectivamente. El objetivo es el determinante más importante de la calidad de la imagen producida por el microscopio y es necesario corregir en cada una de ellas una o más aberraciones o errores. Además del grado de corrección de una lente, la calidad de la imagen está determinada por su AN. Los microscopios compuestos tienen varios objetivos intercambiables, con diferentes poderes de amplificación.
El mecanismo de enfoque consta de un tornillo macrométrico, con el que se cambia rápidamente la distancia entre el objetivo y el espécimen, y de un tornillo micrométrico, para cambiar lentamente dicha distancia. Para la microscopia en campo luminoso de gran resolución, los objetivos de inmersión (AN = 1,2 a 1,4 ) son muy útiles. El aceite que se emplea para la inmersión de estos objetivos es un líquido viscoso que no seca y es refractivamente estable, con un índice de refracción de 1,51. El aumento total de un microscopio luminoso se calcula multiplicando el poder de aumento del objetivo por el de la lente ocular. Ejemplo: ocular (10X) y objetivo (40X): 10 x 40= 400 diámetros de aumento. Los microscopios usados en bacteriología utilizan, por lo general , los objetivos de 90 o 100 diámetros de aumento con oculares de 10 diámetros, amplificando de 900 a 1 000 veces; por lo que una partícula observada de 0,2 mm de diámetro puede ser amplificada hasta 0,2 mm, resultando claramente visibles. En los microscopios luminosos el poder de resolución puede mejorarse mediante el uso de luz con longitud de onda más corta, de aproximadamente 0,2 mm, que permite una resolución de partículas de 0,1 mm de diámetro. La microscopia en campo iluminado o claro es la más usada para la observación de frotis coloreados, pero puede también emplearse para examinar características morfológicas y la movilidad de los organismos en preparaciones denominadas “gotas colgantes” o “en fresco” (suspensión del microorganismo en una gota de líquido, colocada sobre lámina portaobjeto y cubierta con lámina cubreobjeto).
Otro ejemplo de microscopio compuesto de gran utilidad en los laboratorios de microbiología y parasitología médicas, es el microscopio estereoscópico, el cual combina dos microscopios compuestos que producen imágenes separadas para cada ojo a un ángulo ligeramente diferente. Pueden contar con uno o con dos objetivos. Puede utilizarse luz reflejada o luz transmitida, pero como no tiene condensador, el tipo y la intensidad de la iluminación son factores limitantes. Estos microscopios son muy útiles para examinar las características de las colonias de bacterias, hongos, cultivos de tejidos y otros organismos parásitos.
Clasificacion de Microscopias
Microscopia De Contraste de Fases
Se fundamenta en el hecho de que las ondas luminosas que pasan a través de objetos transparentes, como las células, emergen en fases diferentes dependiendo de las propieda- des de los materiales que atraviesan. En 1934, Zernike desarrolló métodos ópticos para separar las ondas luminosas incidentes y difractadas, amplificando así la diferencia de fases entre ellas. Un sistema óptico especial convierte esta diferencia de fase en una diferencia de intensidad; de este modo, unas estructuras aparecen más oscuras que otras. En el microscopio de contraste de fases, el condensador tiene un diafragma anular que produce un centro luminoso hueco y el objetivo está acondicionado para acentuar los cambios de fases producidos en la muestra. Una ventaja es la posibilidad de diferenciar las estructuras internas de células vivas, pues con el microscopio ordinario lo usual es la observación de preparaciones de materiales muertos y teñidos.
Microscopia de Campo Oscuro
Se utiliza el mismo microscopio luminoso, empleando un condensador cuya apertura numérica es mayor que la del objetivo y bloquea los rayos de luz directos, así como desvía la luz de un espejo al lado del condensador en un ángulo oblicuo. De esta manera se crea un campo oscuro que produce contraste contra los bordes destacados de los microorganismos y se origina cuando los rayos oblicuos son reflejados del borde del microorganismo hacia arriba, al objetivo del microscopio. Como los objetos luminosos contra fondo oscuro son percibidos por el ojo más fácilmente, este tipo de iluminación para observación microscópica es útil para visualizar flagelos bacterianos y bacterias espirilares mal definidas con la microscopia de campo claro y de contraste de fase.
Microscopia Por Flourescencia
Este tipo de microscopio se basa en el principio de remoción de la iluminación incidente por absorción selectiva, transmisión de la luz absorbida por la muestra y reemitida con diferente longitud de onda. Los compuestos capaces de absorber luz de una determinada longitud de onda y de emitir luz de mayor longitud de onda, se denominan fluorocromos. Las longitudes de onda absorbidas y emitidas dependen de los fluorocromos utilizados. El rayo luminoso emitido desde la fuente pasa por un filtro de excitación que elimina las longitudes de onda que no sirvan para excitar al fluorocromo utilizado. La luz que la muestra hace fluorescente se transmite a través de un filtro de barrera que elimina del rayo a la longitud de onda incidente. De esta manera, sólo la luz que ha interactuado con la muestra con un cambio de longitud de onda, contribuye a la intensidad en el plano de la imagen.
Diferentes fluorocromos son empleados en la práctica, entre los cuales podemos mencionar la auramina y la naranja de acridina, de uso en la tinción directa de microorganismos. En los laboratorios de microbiología médica se utilizan para la detección de microorganismos en hemocultivos y para la observación de bacilos acidorresistentes en frotis. Otros fluorocromos, tales como isotiocianato de fluoresceína, pueden ser conjugados a anticuerpos y se emplean en los laboratorios en técnicas conocidas como inmunofluorescencia, que permiten, con una alta sensibilidad y especificidad, localizar antígenos en una muestra dada. Dos técnicas básicas de inmunofluorescencia son usadas en microscopia: directa e indirecta. Con la técnica directa, la muestra en estudio se fija a una lámina portaobjeto y se le adiciona un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína. Si el antígeno corres- pondiente se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo se le une. La lámina se observa al microscopio por fluorescencia y el fluorocromo unido a la inmunoglobulina y a su antígeno, emite luz de una longitud de onda visible. El observador la percibe con un color brillante en intenso contraste con los no coloreados y con el fondo de la preparación.
La inmunofluorescencia directa es muy utilizada en los laboratorios para identificar, de manera relativamente rápida, antígenos virales en células de especímenes clínicos (virus respiratorios, herpesvirus, etc.) y para el diagnóstico de otros agentes microbianos tales como:
- Bordetella pertussis
- Legionella pneumophila
- Streptococcus pyogenes
- Francisella tularensis
- Chlamydia trachomatis
- Cryptosporidium paarvum
- Giardia lamblia
- Entre otros
Las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFA) se basan en tener un colorante fluorescente conjugado a un anticuerpo secundario (anticuerpo antiinmunoglobulina). El antígeno se puede encontrar en la muestra fijada sobre la lámina portaobjeto sobre la cual se hace reaccionar un anticuerpo conocido dirigido a localizar los antígenos en la muestra. Después de realizar un lavado con el fin de remover el anticuerpo no fijado, se adiciona el conjugado formado por el anticuerpo antiinmunoglobulina y la fluoresceína, el que se une al anticuerpo primario (inmunoglobulina) si está presente. El complejo formado por el antígeno, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario conjugado, puede ser visualizado de la misma manera que en el método de inmunofluorescencia directa.
Entre las ventajas de la técnica indirecta se encuentran, su mayor sensibilidad, la posibilidad de utilizar el anticuerpo secundario conjugado para la detección de diferentes anticuerpos primarios y la probabilidad de poder cambiar la especificidad del anticuerpo secundario para detectar la clase de anticuerpo que está presente en una muestra. La desventaja es que su proceder técnico lleva varios pasos, los cuales la hacen un poco más larga que la prueba directa y al igual que esta, requiere personal técnico bien adiestrado.
Microscopio Electrónico
El microscopio electrónico ha hecho posible resolver el detalle celular a nivel molecular y ha permitido a los científicos poder observar las estructuras detalladas de las células procariotas y eucariotas. En el campo de la virología ha constituido un instrumento muy valioso, pues permitió la observación y la identificación de virus. Este microscopio usa una corriente de electrones en lugar de rayos luminosos para producir la imagen magnificada de un objeto, lo cual le confiere una mayor resolución, debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que los fotones de la luz blanca. Electrones acelerados en un campo eléctrico están asociados con longitudes de ondas cortas. Por ejemplo, electrones acelerados en un campo de 100 kV tienen longitudes de onda de aproximadamente 0,004 nm.
El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene muchas características en común con el microscopio luminoso. Fue el primero de los microscopios electrónicos y emplea un rayo de electrones, dirigido o enfocado por un lente condensador electromagnético sobre una muestra delgada. Al chocar los electrones con la muestra, se diseminan de manera diferencial, algunos pasan a través de la muestra y se reúnen y enfocan mediante lentes objetivos electromagnéticos que presentan una imagen de la muestra al sistema de lentes proyectores, para una amplificación posterior. La imagen se visualiza permitiendo que caiga en una pantalla que fluoresce cuando recibe el impacto de los electrones. Tiene un gran poder de resolución, permite la observación de partículas separadas por 0,001 m, con diámetros entre 0,001 y 0,2 m . En el microscopio electrónico de barrido (MEB), los electrones se enfocan mediante lentes en un punto muy fino y su interacción con la muestra libera diferentes tipos de radiaciones (electrones secundarios) de la superficie del material, que son capturadas por un detector, amplificadas y luego transformadas en imágenes en una pantalla de televisión. Este microscopio tiene un poder de resolución más bajo que el MET y resulta muy útil para la observación tridimensional de objetos microscópicos.
- Técnicas
Las técnicas convencionales más usadas en la microscopia electrónica son:
- La tinción negativa.
- La microtomía.
- La congelación.
La tinción negativa ha tenido amplia aplicación en el estudio de las macromoléculas, virus y organelas bacterianas. Los otros dos métodos ofrecen información sobre la morfología de las subunidades de las estructuras celulares y se han usado con éxito en el estudio de los antibióticos y su acción sobre las membranas de las bacterias y los hongos. Una técnica importante en la microscopia electrónica es el uso del “sombreado”, consistente en el depósito de una capa delgada de metal pesado sobre la muestra, la que se coloca en la vía del rayo de iones metálicos, en un vacío. Al obtener una impresión positiva de una imagen negativa, se logra un efecto tridimensional.
Coloraciones
Un colorante biológico es una molécula que es capaz de unirse a una estructura de la célula y darle color. Los colorantes se emplean también en la constitución de los medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores. En microbiología, las coloraciones tienen diferentes objetivos: demostrar los microorganismos y algunas otras células en diferentes especímenes; poner de manifiesto algunas características morfológicas y estructuras microbianas tales como: esporas, flagelos, gránulos, cápsulas, etc., y diferenciar los microorganismos según su comportamiento tintorial. Los colorantes que se extraen de productos vegetales o animales se denominan colorantes naturales, entre los que se encuentran: el carmín, el tornasol, el índigo y la hematoxilina. Otros, como los extraídos del alquitrán de hulla, son anilinas sintéticas. En la actualidad, el término colorante de anilina se está abandonando porque muchos de los colorantes sintéticos en uso, no derivan de la anilina. Los ácidos y las bases libres son, en general, poco solubles, por lo que en microbiología se utilizan casi exclusivamente las sales de los ácidos y de las bases colorantes. Los llamados colorantes básicos contienen un catión coloreado unido a un anión incoloro y los ácidos constan de un catión incoloro unido a un anión coloreado. Los básicos son los más usados en bacteriología, debido a que las bacterias, ricas en ácidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos, los que se combinan con los colorantes cargados positivamente.
Entre los colorantes básicos, los más empleados son: tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo, safranina y verde de malaquita. Entre los ácidos podemos citar: naranja G, ácido pícrico, fucsina ácida y eosina. Los colorantes ácidos se utilizan en técnicas especiales, coloraciones negativas o en métodos para estudiar algunas estructuras bacterianas, fundamentalmente citoplasmáticas. Existe un grupo de sustancias, cuya base y ácido tienen carácter colorante, y son denominadas colorantes neutros. Entre ellos se encuentra el grupo de los eosinatos: eosinato de azul de metileno,de azul de toluidina de violeta de metilo.
Enlaces externos
- Microscopio de fluorescencia. Disponible en: Wikipedia Consultado el 5 de septiembre de 2019.
- Microscopía. Disponible en: Facmed Consultado el 5 de septiembre de 2019.
- Tipos de Microscopia. Disponible en: Ipb Consultado el 5 de septiembre de 2019.
- Microscopia de Campo Oscuro. Disponible en: Técnica en Laboratorios Consultado el 5 de septiembre de 2019.
Fuentes
- Microscopía.Disponible en: Wikipedia Consultado el 5 de septiembre de 2019.
- Manual de Microscopía. Disponible en: Microscopia. Consultado el 5 de septiembre de 2019.
- Microscopio electrónico. Disponible en: Wikipedia Consultado el 5 de septiembre de 2019.
