Marcadores moleculares

Marcadores moleculares Concepto: segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el análisis del genoma. En 1996, Ferreira y Grattapaglia amplían el concepto definiendo los marcadores moleculares como cualquier fenotipo molecular originado de la expresión de un gen o un segmento específico de ADN.

Marcadores Moleculares: Segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el análisis del genoma. En 1996, Ferreira y Grattapaglia amplían el concepto definiendo los marcadores moleculares como cualquier fenotipo molecular originado de la expresión de un gen o un segmento específico de ADN.

Definición

En la literatura se encuentran varias definiciones del término marcador molecular; Caetano-Anolles (1991) los define como segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos de referencia para el análisis del genoma. En 1996, Ferreira y Grattapaglia amplían el concepto definiendo los marcadores moleculares como cualquier fenotipo molecular originado de la expresión de un gen o un segmento específico de ADN.

Características generales de los Marcadores Moleculares

A diferencia de los marcadores morfológicos, los marcadores moleculares pueden ser utilizados para la detección y caracterización de genotipos a partir de células o tejidos en cualquier estadio fisiológico, facilitándose así la aplicación de métodos tempranos de selección y recombinación de los individuos de interés para el mejorador genético (Morell y col., 1995).

Los marcadores morfológicos son en su mayoría dominantes o recesivos, sin embargo, la expresión de los marcadores moleculares es codominante, pueden detectar un nivel de polimorfismo elevado y tienen como ventajas adicionales su amplia distribución a lo largo de todo el genoma, su carácter heredable siguiendo el modelo de Mendel y los nulos o mínimos eventos de pleiotropía y epistasia que tienen lugar, reduciendo junto a otros factores, la interacción genotipo-ambiente a su mínima expresión.

Tipos de Marcadores

Además de los marcadores morfológicos, se han descubierto otro tipo de marcadores genéticos como los isoenzimas en la década de los años 70, y marcadores moleculares como los RFLPs (restricted fragment length polymorphisms) en los años 80, y los RAPDs (random amplified polymorphic DNA) en los años 90. Estos marcadores han permitido el confeccionar mapas de ligamiento de alta densidad en el genoma.

Existen mapas de ligamiento con marcadores moleculares muy completos en varios cultivos como eltomate, maíz, trigo, cebada, soja, almendro, Brassica, etc. Estos marcadores con un efecto neutro o al menos no adverso en la planta pueden ser una ayuda valiosa en la selección.

Clases de Marcadores Moleculares

Existen dos grandes clases de marcadores moleculares: los marcadores de postranscripción-traducción, que son aquellos determinados por análisis indirecto del DNA y los marcadores del tipo pretranscripción-traducción, que han revolucionado la genética vegetal a partir de la introducción de novedosas tecnologías que permiten el análisis directo del DNA.

Marcadores moleculares del tipo postranscripción-traducción

Entre los marcadores moleculares del tipo postranscripción-traducción se encuentran las isoenzimas; así se definen las múltiples formas moleculares de una misma enzima que existen en una especie.

Brown y Moran , describen la técnica isoenzimática como el mejor método corriente para medir variaciones genéticas cercanas al nivel del DNA, relativamente libres de efectos ambientales y sobre un número de muestras manipulables.

La poca cantidad de tejido que se requiere para la elaboración del ensayo, su relativamente rápida ejecución, el bajo costo del ensayo y la moderada facilidad para obtener y analizar resultados, cuentan entre las principales ventajas de este marcador.

Los perfiles electroforéticos se han empleado para varios sistemas enzimáticos en la clasificación de especies y variedades, y han contribuido significativamente en diversos aspectos del mejoramiento. Sin embargo, estos marcadores presentan algunas limitaciones en particular cuando se requiere una cobertura más amplia del genoma, debido a la escasa disponibilidad de marcadores en el mismo y el bajo número de alelos por locus. Además de forma general, la especificidad de las formas isoenzimáticas en algunos tejidos vegetales, la influencia sobre la actividad enzimática de las condiciones ambientales y los diferentes estadios del desarrollo vegetal, cuentan entre sus desventajas.

Marcadores moleculares del tipo pretranscripción-traducción

Los marcadores moleculares de tipo ADN, son aquellos capaces de detectar el polimorfismo genético directamente a nivel de DNA. En este grupo se encuentran los RFLP (Fragmentos Polimórficos de Restricción), RAPD (DNA Polimórfico Amplificado al Azar), AFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados), entre otros y ocupan un peldaño superior en la escala evolutiva de los marcadores genéticos, por las nuevas perspectivas que brindan para identificar y mapear genes útiles, que pueden ser posteriormente incorporados y expresados en el genoma vegetal (Ferreira y Grattapaglia, 1996).

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphic)

Se entiende por RFLP el polimorfismo de los fragmentos de restricción, obtenidos por el corte con una endonucleasa en la cadena doble del ADN, acoplado en el caso de ADN genómico eucariótico, por hibridación con sondas de secuencias homólogas de copia única (Botstein y col., 1980; Beckmann y Soller, 1986).

El empleo de los RFLP permite detectar variaciones producidas por procesos como las deleciones, inserciones, o alteraciones en la secuencia diana de las endonucleasas de restricción (siendo esta su base genética), tanto en poblaciones de la misma especie como entre diferentes especies, lo cual resulta ventajoso atendiendo a que muy pocas variaciones son expresadas en el fenotipo, mientras que muchas otras resultan silentes (Iglesias y Rojas, 1992).

De acuerdo con Beckmann y Soller (1986), se pueden distinguir dos campos principales de aplicación de los RFLP en el mejoramiento de las plantas. El primero está basado en la utilización de los mismos como marcador genético para determinar las relaciones genéticas, incluyendo aspectos esenciales como su uso en la identificación de variedades, la protección de los derechos del mejorador y las determinaciones de parentesco. La segunda área de aplicación, está basada en el uso de éstos como marcadores genéticos para identificar y mapear particularmente aquellos genes involucrados directamente en la determinación de caracteres cuantitativos, y el monitoreo de estos loci durante los programas de introgresión y selección (Iglesias y Rojas, 1992).

RAPD (Ramdom amplified polymorphic DNA)

En 1990 dos grupos de investigadores desarrollaron prácticamente al unísono una tecnología basada en la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En esencia la idea consistió en utilizar un cebador corto y de secuencia arbitraria, que elimina la necesidad de conocimiento previo de la secuencia. Estos dos grupos denominaron de forma diferente esta técnica: AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction o reacción de la polimerasa con cebadores arbitrarios) y RAPD (Ramdom Amplified Polymorphic DNA o ADN polimórfico amplificado al azar) desarrollada por Williams y colaboradores (1990).

Posteriormente Caetano-Anolles y colaboradores (1991) pusieron a punto otra variante que denominaron DAF (DNA Finger Printing o amplificación de huellas de DNA). Actualmente se ha propuesto designar todas estas tecnologías como MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling).

La naturaleza molecular del polimorfismo RAPD no es enteramente conocida. Ferreira y Grattapaglia (1996), basados en evidencias experimentales, señalan que diferencias de apenas un par de bases (mutaciones puntuales) son suficientes para causar una “no complementariedad” del cebador con el sitio de iniciación y así impedir la amplificación de un segmento. Otras fuentes de polimorfismo pueden incluir deleciones o inserciones en los sitios de iniciación, que los coloque a una distancia superior a lo permisible y así impedir la amplificación de un segmento (Tingey y Del Tufo, 1993).

El polimorfismo genético detectado con este marcador es binario lo que hace que la naturaleza de la técnica RAPD sea dominante, los individuos heterocigóticos no pueden ser diferenciadas directamente de los homocigóticos, esta característica constituye una de sus principales limitaciones determinando un bajo contenido de información genética por locus (Williams y col., 1990). Sin embargo, las evidencias existentes, indican que los loci de los marcadores RAPD están distribuidos al azar a lo largo del genoma, lo que permite detectar una gran cantidad de polimorfismo, incluso en regiones de DNA repetitivo (Rojas y col.,1994 ).

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

La técnica del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, se considera una técnica intermedia entre RFLP y RAPD, pues involucra una digestión del DNA con enzimas de restricción y la amplificación de los fragmentos generados mediante un PCR específico. Los productos amplificados son usualmente separados sobre un gel de secuenciación y pueden ser revelados después por radiografía o fluorescencia. El polimorfismo creado será el resultado de cambios en los sitios de corte de las endonucleasas y de la variación en número y longitud del amplicon seleccionado para la amplificación de los distintos segmentos (Caetano-Anolles y col., 1991).

Estos marcadores han encontrado un amplio uso en muchas aplicaciones de la biología molecular, especialmente en plantas, destacándose por la alta identificación de genotipos y evaluación del germoplasma que permiten (Paterson y col., 1991).

Usos de los marcadores

Los marcadores moleculares se han utilizado o se pueden utilizar en los siguientes aspectos de la mejora genética de plantas:

(A) Estimación de distancias genéticas entre poblaciones, variedades, líneas puras e híbridos (3). Esto permite: (i) la clasificación taxonómica de ecotipos o muestras que acceden a los Bancos de Germoplasma como un complemento de los datos morfológicos que han sido utilizados desde los tiempos de Linneaus; y (ii) la asignación de líneas puras a grupos heteróticos con objeto de predecir el valor de los híbridos resultantes del cruce. Las distancias genéticas mas usadas son la modificada de Rogers (9) utilizada con poblaciones segregantes y la de Nei-Li (7) utilizada con líneas puras e híbridos.

(B) Identificación y distinción de variedades, líneas puras e híbridos para proteger los derechos del obtentor vegetal en el Registro de Variedades Protegidas. Los marcadores de DNA permiten una distinción mas precisa de genotipos que los "descriptores" morfológicos requeridos hoy día. Sin embargo estos marcadores moleculares no han sido todavía adoptados por los organismos oficiales encargados de la protección de variedades.

(C) Establecimiento de relaciones de parentesco o "pedigree" entre líneas o variedades para realizar estudios genéticos. El método es similar al utilizado en las pruebas de paternidad y parentesco en genética humana.

(D) Localización e identificación de genes cualitativos o mayores y también de genes con efectos pequeños afectando a caracteres cuantitativos (los así llamados QTLs).

Aplicaciones prácticas de los Marcadores

Además de la identificación de genes mayores asociados a marcadores moleculares (1), se han detectado QTLs en varios cultivos, por ejemplo en tomate, maíz, soja, cebada, etc. Se han identificado QTLs responsables del contenido de los sólidos solubles del tomate en la generación de retrocruzamiento derivada del cruce entre dos líneas que diferían ampliamente en el contenido de los sólidos solubles (8 y 12). También, varios QTLs del maíz controlando el rendimiento y otros caracteres agronómicos (altura de la planta, longitud de la espiga, etc.) han sido identificados y localizados en las regiones cromosómicas del híbrido B73 x Mo17, cultivado extensamente en todo el mundo (11). Otros QTLs responsables de la resistencia del maíz al gusano europeo del taladro del tallo (Ostrinia nubilalis) han sido detectados en poblaciones segregantes. Otros muchos ejemplos podían citarse.

Las regiones cromosómicas portadoras de los QTLs identificados mediante los marcadores son demasiado largas (5-30 cM) para aislar, clonar y manipular el DNA informativo del QTL por sí mismo. Por tanto la estrategia que se sugiere en la mejora de plantas es seleccionar individuos portadores de marcadores con QTLs favorables y asistir o ayudar en la selección cuando se empleen los métodos convencionales de mejora; por ejemplo en la selección genealógica, en la selección con base en "test-crosses", o en la selección en retrocruzamientos, etc. El método es sencillo, seguir la pista del gen marcador asociado al QTL favorable a través de las sucesivas generaciones de selección.

Este tipo de selección asistida se esta usando ya hoy día en varios laboratorios de Universidades, Centros Públicos y Empresas privadas grandes, pero es presumible que en el futuro pueda convertirse en un proceso rutinario en la mayoría de los programas de mejora de plantas, especialmente para el desarrollo de líneas puras y de híbridos.

Fuentes

• Ashari, S., D. Aspinall y M. Sedgley: identification and investigation of relationsships of mandarin types using isozyme análisis, Scientia Horticulture, 40, 305-315, 1989.
• Beckmann, J.S. y M. Soller: Restriction Fragment Lengh Polymorphisms and genetic Improvement of Agricultural Species, Euphytica, (35),111-124, Wageningen, 1986.
• Botstein, D. et al.: Construction of a Genetic Linkage Map in man using Restriction Fragment Length Polymorphism, Am. J. Hum. Genet., (32), 314-333, Chicago, 1980.
• Brown, A. H. D. y G. F.Moran.: Isozymes and the genetic resources of forest trees, Proc. Symp. Isozymes of North American forest trees and forest insects, USDA Forest Serv. Gen. Tech. Rep., pp. 1-10, Berkerley CA., 1981.
• Brown, A. H. D.y M. T. Clegg: Isozyme assessment of plant genetic resource, Isozymes: Current topics in biological and medical research, Proc. 4 .Intern. Cong., (2), 285-295,Austin, 1983.
• Caetano-Anolles, G., B. J. Bassam y P. M. Gresshoff: DNA Amplification Fingerprinting: A strategy for Genome Analysis. Plant Molecular Reporter , 9, 294-307, 1991.
• Espino, E. y G. Torrecilla: El Tabaco Cubano: Recursos Fitogenéticos, 56p., Editorial Científico-Técnica, 1999.
• Ferreira, M.E. y D. Grattapaglia: Introducao ao uso de marcadores moleculares em análise genética, Ed.2, 220 pp. EMGRAPA-CENARGEN, 220p, Brasilia, 1996.
• Iglesias L. y R. Rojas: Utilización del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) en los programas de mejoramiento genético en plantas, Cultivos Tropicales, 13, (1), 74pp., La Habana, 1992.
• Iglesias, L.: Aplicación de la técnica electroforética en el manejo de los recursos fitotécnicos. Conferencias, 6p, 1988.
• Markert, C. L. y F. Moller: Multiple forms of enzimes tissue, ontogenetics and species especific patterns, Proc. Nat. Acad. Sci, 45, 753-763, USA, 1959.
• Messmer, M., A. Melchinger, M. Lee, W. Woodman, E. Lee, K. Lamkey. Genetic Diversity Among Progenitor and Elite Lines From Iowa Stiff Stalk Synthetic (BSSS) Maize Population: Comparison of Allozyme and RFLP Data, Theoretical and Applied Genetics, (83), 97-107, 1991.
• Morell, M.K., R. Peakall, L.R. Preston y H. L. Lloyd: DNA Profiling Techniques for Plant Variety Identification, Australian Journal of Experimental Agriculture, (35), 807-819, 1995.
• Paterson, A. H., Susan Damson: Mendelian Factors Underlying Quantitative Traits in Tomato: Comparison Across Species, Generations and Environments, Genetics, 181-187, Austin, 1991.
• Rojas, R., B. Corona y D. Rivas: Marcadores de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) y polimorfismo genético, Cultivos Tropicales, 15(1), 82-84, La Habana, 1994.
• Tingey, S. V. y J. P. Del Tufo: Genetic Analysis whit Random Amplified Polymorphic DNA Markers, Plant Physiol., 101, 349-352, 1993.
• Williams, J. G. K., A. Kubelik, K. J. Rafalski y S. V. Tingey: DNA polimorphisms amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers, Nucleic Acids Research, (18), 6531-6535, 1990.
• Zhang, Q., M. A. Saghai-Maroof y A. Kleinhofs: Comparative Diversity Analysis of RFLP and Isozyme Within and Among Populations of Hordeum vulgare ssp. Spontaneum, Genetics, (134), 909-916, 1993.