Sonda molecular
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Las Sondas Moleculares son dispositivos que emplean moléculas detectoras para detectar, investigar o analizar otras moléculas, macromoléculas, agregados moleculares u organismos.
Sumario
Sonda Molecular
Una sonda es un fragmento de ADN o raramente ARN de pequeño tamaño normalmente entre 100 y 1000 bases usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual.
En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria ADN ó ARN mediante un mecanismo de hibridación que forma una estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unión se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formándose pares de bases complementarias.
Marcaje
Para visualizar las moléculas diana se utiliza una sonda marcada, bien radiactivamente, bien mediante marcaje inmunológico. Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad.
Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de unión se detectan porque los métodos de marcaje dejan una señal detectadle mediante fotografía.
En los métodos más avanzados se utilizan marcajes mediante flororescencia que emiten señales detectadas mediante láser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
Inmunológico
Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro asociado a la utilización de radiactividad. Para evitar este peligro se desarrollaron otros métodos de marcaje basados en anticuerpos.
Las sondas se marcan utilizando nucleótidos que llevan unida una molécula digoxigenina, a la solución se le añaden anticuerpos específicos que se unen a esa molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o fluorescente Como el CDP-Star que deja impronta fotográfica.
Radiactividad
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizada nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, pero también es frecuente el uso de tritio.
Southern y northern
Independientemente de la naturaleza de la sonda utilizada ADN ó ARN, las hibridaciones efectuadas sobre ácidos nucleicos inmovilizados en membranas o in situ, serán de tipo Southern cuando se use ADN como diana a detectar y de tipo northern cuando la diana a detectar sea mayoritariamente de ARN.
Desarrollos tecnológicos en Medicina Molecular
Para poder analizar la información contenida en las largas cadenas de ADN que forman los cromosomas, hay que realizar mapas que zonifiquen la información y que permitan estimar cambios que puedan ser responsables de enfermedad.
Los mapas cromosomales sólo dan una idea general de la morfología y número de los mismos sin reflejar detalles moleculares que permitan dar una idea de la estructura y contenido de la información genética.
Historia
Al finalizar la década de los ’60 y al comienzo de los ’70, Smith, Nathans y Arber aislaron unas enzimas provenientes de bacterias que llamaron endonucleasas de restricción La característica que hacía a estas enzimas tan especiales era que podían cortar el ADN en secuencias específicas de nucleótidos, funcionaban como un bisturí molecular.
Podemos usar endonucleasas de restricción para elaborar mapas de restricción de una muestra de ADN y compararlo con otra muestra de ADN donde se sospecha que ha sucedido una mutación. Si la mutación afecta la secuencia de un sitio de restricción entonces este desaparece y el patrón de digestión del ADN cambia.
También por este tiempo se descubre otra enzima llamada ADN ligasa, la cual se encarga de unir pedazos de ADN, como especie de suturas moleculares. No es difícil imaginar que sucedió luego al combinar estas dos tecnologías, la posibilidad de hacer "ADN recombinante"; al unir pedazos de ADN que no necesariamente provienen del mismos organismo. En 1972, Berg realiza la primera molécula de ADN recombinante y nace la Ingeniería Genética una forma de cirugía molecular.
En este mismo año Cohen y sus colegas demostraron que fragmentos de ADN pueden ser ligados a fragmentos circulares de ADN de origen bacteriano llamados Plásmidos, que luego son reintroducidos en bacterias y son replicados ilimitadamente, es decir clonados. El primer gen eucariota en ser clonado fue la b globulina de conejo en 1976.
Métodos
Otra forma de analizar el ADN es estudiando su estructura primaria, es decir leer las bases que lo componen. Esto fue posible gracias a dos métodos de secuenciación desarrollados en 1975 y 1977 por F. Sanger y W. Gilbert. Al analizar algunos genes se observó que en eucariotas estos son discontinuos, es decir, las secuencias codificantes son interrumpidas por segmentos espaciadores que no son traducidos. Para distinguir entre estos dos tipos de secuencias, en 1978 Gilbert acuño los términos de exon e intron.
Desarrollo de sondas moleculares
Mediados de los años ’60, surgió a partir de la observación de que las dos hebras de ADN pueden ser separadas y luego re-hibridizadas en base a la propiedad de complementariedad de los ácidos nucleicos.
Las sondas moleculares son pequeños fragmentos, generalmente de ADN, que pueden ser marcados. De esta manera podemos digerir muestras de ADN con enzimas de restricción, separar los distintos fragmentos generados en base a sus diferencias en tamaño en una electroforesis, transferir los fragmentos a membranas sólidas e hibridizar con la sonda molecular marcada. Este proceso fue desarrollado por E. M. Southern en 1975 y es conocido como Southern blotting y es de mucha utilidad hoy día en el diagnóstico molecular.
Basados también en la propiedad de complementariedad de los ácidos nucleicos y en la síntesis in vitro de ADN usando ADN polimerasa, en 1985 K. Mullis y colegas desarrollaron una poderosa técnica de amplificación específica de fragmentos de ADN. Esta técnica es mejor conocida como la reacción en cadena de la polimerasa Polimerase Chain Reaction o PCR. En un corto período de tiempo, la PCR se ha convertido en una pieza importante en el diagnóstico y en la investigación en la biología molecular. Hoy día es posible amplificar fragmentos de ADN provenientes de una sola célula.
Estrategias
Dichas Variaciones y combinaciones de estas técnicas y conocimientos provenientes de la biología molecular, han desencadenado innumerables estrategias para estudiar el material genético y la información contenida en el mismo. Cabe destacar en este momento uno de los proyectos de mas alta envergadura en la medicina molecular, el Proyecto Genoma Humano.
Proyecto Genoma Humano
Es una iniciativa multidisciplinaria e internacional iniciada por el Departamento de Energía y el Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos de Norteamérica que comenzó a operar en 1988. El objetivo de este proyecto es el clonar y secuenciar por completo el genoma humano antes del año 2005. Dos componentes esenciales en este proyecto son el realizar mapas genéticos y físicos en el ser humano.
El otro componente fundamental es la Informática, es decir, como los datos generados son almacenados y distribuidos rápidamente a la comunidad científica para su análisis y el desarrollo de herramientas que faciliten el mismo.
